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【求助】关于TRIzol提取RNA的工作原理,以及各步试剂...
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我想请问一下,关于TRIzol提取RNA的工作原理,以及各步试剂加入的作用。谢谢
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2015-6-02 15:19 作者: hyuu 来源: 分析测试百科网
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园丁## (2015-6-02 15:19:25)
一. RNA提取
1. -80oC取标本
2. 取组织
3. 液氮中陶瓷研钵研磨,组织呈粉状时转移到预先称重的5毫升的塑料离心管中,离心管需要DEPC水处理后,灭菌。称重,得组织100mg
4. 加入TRIZOL 1.5ml(-60 oC—-70oC下,可存放1个月)
5. 室温保温5min
6. 加入氯仿0.3ml,盖紧手震动混匀15s
7. 室温2-3min
8. 4 oC,12000g 15min
9. 取上清约0.8ml,转移到1.5ml离心管中,管子处理同上,去净上清的中下层液体用于DNA和蛋白质的提取
10. 加异丙醇0.7ml,混匀,室温下10min
11. 4 oC,10000g 10min
12. 弃上清,加1.4ml 75%乙醇(以DEPC处理灭菌水配制)混匀
13. 4 oC,7000g 5min
14. 弃上清,室温干燥5min
15. DEPC处理灭菌纯水100ml溶解,-70 oC保存
二. DNA提取
1. 去净上清的中下层液体约0.6ml,加入100%乙醇0.45ml,混匀
2. 室温下2-3min
3. 4 oC,5000g 5min
4. 去除液体,可保留用为蛋白提取
5. 加入0.1M柠檬酸钠75%乙醇溶液洗涤1.4ml DNA沉淀,室温下30分钟,间断混匀
6. 4 oC,2000g 5min
7. 重复洗涤一次
8. 加入0.1M柠檬酸钠75%乙醇溶液洗涤1.4ml DNA沉淀,室温下15分钟,间断混匀
9. 4 oC,2000g 5min
10. 室温下干燥5-15min
11. 在300-600ml 8mM NaOH中溶解,DNA浓度约为0.2-0.3 mg/ ml
12. 若有不溶物,12000g 10min
13. 上清可以在4 oC存放过夜
14. 长时间保存需要用HEPES加1mM EDTA调整pH至7-8。
三. 蛋白质提取
1. 转移上清到5ml的离心管中,大约体积为1ml
2. 加入2.3ml异丙醇(1.5ml/mlTRIZOL),室温下保温10min
3. 4 oC,12000g 10min
4. 加入3ml(2ml/mlTRIZOL)含0.3M盐酸胍的95%乙醇,室温下20min
5. 4 oC,7500g 5min
6. 重复洗涤3次
7. 加入2ml乙醇,室温下20min
8. 4 oC,7500g 5min
9. 真空干燥蛋白沉淀5-10min,1%SDS溶解
10. 完全溶解需要在50 oC保温,不溶物可4 oC 10000g 10min离心去除
11. 上清转移至新管,可用于Western blotting或-20oC存放
woshi (2015-6-02 15:19:43)
TRIzol主要物质是异硫氰酸胍,它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时,保护RNA的完整性 。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后,RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA 对于样品间标准化RNA 的产量十分有用。
无论是人、动物、植物还是细菌组织,TRIzol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。如果是用于PCR,当两条引物位于单一外显子内时,建议用级联扩大的DNase I(Cat.No. 18068)来处理抽提的总RNA。
TRIZOL 试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA 的析出。例如,从大鼠肝脏抽提的RNA 琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色,可见许多介于7 kb和15 kb 之间不连续的高分子量条带,(mRNA 和hnRNA 成分)两条优势核糖体RNA 条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S),低分子量RNA 介于0.1 和0.3 kb之间(tRNA, 5S)。
提取时需要注意一些问题:提取时要做到超净台内操作、操作带一次性手套、EP管及Tip头都要用0.1%处理(0.1%DEPC浸泡过夜后,高压蒸气灭菌)、小心、细致、晃动及每次移液要轻。这样做的唯一目的就是两个,一是小心RNAse的污染降解RNA;二是动作过度暴力破坏RNA的完整性。
另外你提的RNA做电泳的问题,一般RNA电泳应该是做甲醛变性电泳,但是一般的琼脂糖电泳也可以,需要上样量稍微大些,并且跑电泳的时间越短越好(这样也是为了减少外界RNAse对RNA的降解),跑完电泳立刻观察,这样也可以,但是如果样品中的RNA量很低或者说不是很高的话是检测不到的。
ldh (2015-6-02 15:20:02)
TRIzol的主要成分是酚.主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质得到释放.同时 TRIzol里加入了可以抑制RNA酶的胍盐.作用自然是抑制RNA酶了.
氯仿可以使蛋白变性 ,降低蛋白的溶解度,
异丙醇是沉淀RNA的,降低了RNA在氯仿中的溶解度.
因为这些试剂都会影响后续实验,所以用酒精洗一到两遍.一是酒精可以溶解一些沉淀中可能的有机物杂质,二是洗掉异丙醇,氯仿试剂,酒精的易挥发性 在这里的到运用,
希望说的够具体了 好运
mimili_901 (2015-6-02 15:20:21)
用Trizol进行抽提,基本就是酸性酚抽提法。
RNA提取主要是内源和外源RNase
trizol中有酚和异硫氰酸胍,和B-巯基乙醇
酚能使核蛋白质与核酸解聚(氯仿也可以),酚虽可有效的变性蛋白质,但是它不能完全抑制RNA酶活性,可以加入0.1%的8-羟基喹啉,与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制。
异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质,并使蛋白质二级结构消失,细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。
B-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。
加入氯仿,虽然有变性蛋白质的作用,但是其主要用处是用来分相,实际上是加速有机相和水相的分层。一般的trizol试剂在4度下是油状悬浮液,提高温度,放置一段时间,自然也会分相。
上层水相,PH 5.1左右,当溶液pH在酸性的时候,DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面,只有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时,DNA就会溶解在水相,(导致PH中性的大概原因是trizol与样品比例不对,应该尽量保证提取量的前提下使trizol过量)
氯仿还可以去除植物色素和蔗糖。在氯仿中加入少许异戊醇目的很简单,为了减少蛋白质变性操作过程中的气泡。
氯仿可以去除核酸溶液中的痕量的酚。
异丙醇沉淀,优点是容积小且速度快,主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA,对5sRNA、tRNA及多糖不产生沉淀,所以RNA电泳的标志性三条带中5sRNA带很不清楚,未必是你的RNA降解。但是难以挥发出去。
最后的乙醇主要是洗涤异丙醇,也可以溶解一部分蛋白,痕量的乙醇很容易挥发掉。
希望能够对你的问题有所帮助,
也希望版主加分,呵呵
vvmmoy (2015-6-02 15:20:38)
abc816 (2015-6-02 15:21:12)
TRIzol的主要成分是酚.主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质得到释放.同时 TRIzol里加入了可以抑制RNA酶的胍盐.作用自然是抑制RNA酶了.
氯仿可以使蛋白变性 ,降低蛋白的溶解度,
异丙醇是沉淀RNA的,降低了RNA在氯仿中的溶解度.
因为这些试剂都会影响后续实验,所以用酒精洗一到两遍.一是酒精可以溶解一些沉淀中可能的有机物杂质,二是洗掉异丙醇,氯仿试剂,酒精的易挥发性 在这里的到运用,
希望说的够具体了 好运!!
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不知道楼上的还来不来论坛,我想弱弱的问下纯花rna需要从提取完后再加TRIzol+氯仿重来一遍,不可以直接从吸取水相后加入氯仿来减少蛋白吗?刚开始做,迷惑太多,希望高手指点。
BUK (2015-6-02 15:21:29)
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