【求助】pcr引物二聚体条带很亮，没有目的条带

最新回复

• H2O (2015-8-05 15:19:05)

  
  会不会引物都结合成二具体了 所以没有扩增出目的片断啊

• 987789 (2015-8-05 15:19:20)

  引物我用oligo评价过，还可以啊，也在NCBI上blast过啊，应该没问题，现在就是说都是二聚体，没有目的条带

• youyou99 (2015-8-05 15:19:50)

  我的情况和你一样，是不是要换引物呀，可我的引物是Takara设计的，后来我也Blast一下，也正确，不知道为什么就P不出来目的条带，真的很郁闷

• 987789 (2015-8-05 15:20:42)

  
  此问题是常见的PCR无结果，建议楼主在本板块内搜索，有很多类似的帖子。
  原因无外乎：
  1. 退火温度设置不合理，采用梯度PCR可进行改进。
  2.模板问题，如模板降解，浓度过低。
  3.试验操作问题，操作不熟练。
  4.机器问题，现在越来越多的问题好像是PCR仪的问题，呵呵
  5.引物问题应该很小，有如此明显的2聚体，说明无降解，重新合成暂时无必要~

• 987789 (2015-8-05 15:21:31)

  我退火温度59°，按照引物合成报告单上进行，
  模板我扩增其它的目的基因是没问题，应该没有降解
  实验操作熟练度话和机器应该还可以，其它的都能扩出来
  我现在继续在扩，改变了一下条件，等出来结果看看

• 987789 (2015-8-05 15:21:50)

  今天把引物浓度降低为终浓度0.5uM，可能以前浓度加的太多了大概今天的十倍，今天扩的到时没有引物二聚体了，但是又出来了非常亮的非特异性条带，不知道为啥么？我退火温度60° ，延伸时间为2min, 30循环

  
  90748932.snap.jpg

• mickeylin (2015-8-05 15:22:13)

  
  有如此强烈的非特异条带，而目的条带如此之弱，可以试着添加辅剂，如10%DMSO以增加特异性。
  楼主既然blast过，特异性结果如何？如果很好可以试着改进条件，如果不佳，尽快换引物~

• 987789 (2015-8-05 15:22:30)

  但是阳性对照特异性还可以丫。这是比对的结果。
  
  [ 本帖最后由 987789 于 2015-8-5 15:32 编辑 ]

  
  89226819.snap.jpg

• ujne (2015-8-05 15:32:39)

  
  我也遇到同样的结果，内参照很亮很干净，可是没有目的条带，只有很亮的引物二聚体。以前同样的条件P出来过，为什么现在出现这样的结果？明天该怎么改进？求教！

• txwuyan (2015-8-05 15:33:00)

  你先看下设计，可能不太好，如能确定这个亮的是杂带，那就提高温度吧，一般小的杂带是比较麻烦点。你的阳性也有两条哦。还是看看设计吧！还有这样的BLAST结果什么都不能说明的！

• 987789 (2015-8-05 15:33:28)

  
  今天又跑了，退火温度由60°升为62°，好像非特异少了一条。但是非特异还是比特异的亮

  
  17025262.jpg

• 987789 (2015-8-05 15:35:02)

  
  我可以可以把目的条带切胶回收后再扩啊

• ujne (2015-8-05 15:36:09)

  
  目的条带很弱，不知道回收结果怎么样，可以不回收，直接当模板做一下。

• bring (2015-8-05 15:36:26)

  老兄你的问题现在解决了吗？我现在也遇到你这种问题了，引物二聚体条带特亮，就像你的一样，我得引物tm值是59.97，我跑过60和57度的结果和你的一样，引物是20um的，延伸1min

• 987789 (2015-8-05 15:37:20)

  QUOTE:

  原帖由 bring 于 2015-8-5 15:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  老兄你的问题现在解决了吗？我现在也遇到你这种问题了，引物二聚体条带特亮，就像你的一样，我得引物tm值是59.97，我跑过60和57度的结果和你的一样，引物是20um的，延伸1min ...

  可以考虑减低引物的量，降引物终浓度05uM

• bring (2015-8-05 15:37:38)

  
  首先谢谢师兄的回复，我用的引物是稀释到20um的然后在20ul体系里面加0.8或1ul的，该是1um吧

• tudou85 (2015-8-05 15:38:17)

  你可做一个梯度PCR，这样可以把退火温度的范围扩到10度左右，比如56℃～66℃或者60℃～70℃之间，如果还是没有结果，那么应该不是退火温度问题，可能是引物本身的问题。另外，体系要合理，特别是Mg与Taq的量过大，好像也可能扩非特异性条带的。细节也要注意，包括严格处理所用的管与枪头，加样准确，在干净的环境中加样，等等。

• bs4665 (2015-8-05 15:38:38)

  
  多谢！呵呵!我得引物是从文献上找到的他能扩的出来按理我也应该可以把

• jude (2015-8-05 15:38:54)

  
  建议重新设计引物，没必要再做太多无谓的尝试

• cj_mondy (2015-8-05 15:39:10)

  
  建议做个巢氏PCR.