查看完整版本请点击这里：
【转帖】药物MTT实验步骤(贴壁细胞)
【转帖】药物MTT实验步骤(贴壁细胞)
相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
个人总结的MTT方法，希望和园友分享下，如果有错误或误解请大胆指出，你们的回复和建议是我前进的动力~~~
谢谢！！
药物MTT实验步骤(贴壁细胞)----个人改进版
by sssholy （2012-10-22）
1. 边缘孔用无菌PBS充填。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为50000个/ml，每孔加入100ul细胞悬液(每孔5000个细胞)。
注：⑴每次加入细胞都使枪头贴着孔底边缘(最好相同位置)，缓慢加入100ul细胞悬液。孔加入顺序：可从上到下，从左到右依次加入。
⑵为了保证细胞密度均匀，最好每加3-5列细胞混匀一下细胞悬液，避免因重力沉降导致细胞密度不均。
⑶每块96孔板加完细胞后，应拿起板子前后左右水平摇晃几下（勿旋转摇晃），使细胞均匀分散。
⑷一般设6个复孔（B-G行），对照孔非常重要，且变异大，故设2列（2，3列为对照孔），4-10或4-11列为给药孔。
⑸边缘孔用无菌PBS充填， 2-11列均可加入细胞。因为要设置调零孔（即不加细胞孔），所以可将第11列设为调零孔，也可将第12列的无菌PBS孔在第2天加药时改为调零孔。
2. 细胞放入培养箱培养，待贴壁后第二天给药（通常前一天下午或晚上铺板，第2天上午给药）。给药方法：先配好药（用EP管配好药），再拿出96孔板，弃去原有培养液（可不用PBS洗，太麻烦了），加入药物。
注：⑴MTT加药时都是先配药再弃去原培养液，最后加入药物。切勿先弃去原有培养液再配药，因为配药一般要花较长时间，若先弃去培养液再配药会导致细胞无营养液体而死亡。
⑵药物是用母液溶于无血清培养基配成工作液，事先算好对照孔，药物孔，调零孔如何配制，如何设置加药顺序。一般越靠中央的孔变异越小，故最重要的给药孔一般放在最中间，次要孔放边缘，调零孔可用第11或12列。
⑶如果某个给药孔需加入2种药物，一般需要一种药物先预处理1-2h（预处理药物可用Ep管配好后再分别加入各孔），1-2h再加入另一种药物（直接加入各孔）。
3.细胞放入培养箱培养24h（或其他指定时间）。
4. 药物作用结束后，每孔加入20ul---MTT(5mg/ml)，培养3-4h。若药物能与MTT反应，可先弃去原培养液，再加入含MTT的培养液（无血清培养液：MTT=5：1配制）。
注：MTT使用前预先解冻。MTT对光敏感，故一般保存于负20℃，配好5mg/mlMTT后我习惯分装于EP管中。
5.终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150ul---DMSO（DMSO可预先算好所需体积加入15ml离心管中）,37℃温箱孵育10分钟或摇床低速振荡10分钟。之后用酶标仪检测OD—490nm（也有测570nm的）各孔的吸光度(A)值。
6.同时设置调零孔（无血清培养基, MTT, DMSO）,对照孔（细胞，最大浓度的药物溶解介质，无血清培养基, MTT, DMSO）。
7.细胞活力（cell viability）：
细胞活力（cell viability of control）=（药物组A值-调零孔A值）/(对照孔A值-调零孔A值）*100%
查看完整版本请点击这里：
【转帖】药物MTT实验步骤(贴壁细胞)
【转帖】药物MTT实验步骤(贴壁细胞)
88256443.snap.jpg
最新回复
vcve (2015-7-11 11:25:02)
66035574.snap.jpg
remenb (2015-7-11 11:25:50)
ending (2015-7-11 15:11:43)
QUOTE:
调零孔我一般设一列6个~milkdog (2015-7-11 15:12:48)
我的意思是数值，OD值？之前我们用DMSO做，调零孔 的数值会超过0.1
vcve (2015-7-11 15:13:16)
QUOTE:
这我还真不清楚，我自己做的MTT调零孔数值都很稳定，OD490一般在0.04-0.07之间我想这可能跟你用的DMSO，无血清培养基有关~~
dog002 (2015-7-11 15:13:39)
vcve (2015-7-11 15:13:59)
QUOTE:
加药一般都用无血清培养基（目的是同步化），体积还是100ul~dog002 (2015-7-11 15:14:21)
3.14 (2015-7-11 15:14:49)
QUOTE:
我也是你这样做的。。。感觉可以吧veiwu (2015-7-11 15:15:04)
vcve (2015-7-11 15:15:27)
QUOTE:
不加血清细胞还是可以生长的，不过长得很慢。至于72h的MTT我没做过，师兄告诉我说没必要换。我觉得要具体看你细胞状态，如果48h细胞死了很多可以考虑换veiwu (2015-7-11 15:15:46)
恩恩，我也打算不换液了。。。细胞接板数目少点好了，谢谢楼主回复~
www.1 (2015-7-11 15:16:22)
谢谢！！
药物MTT实验步骤(贴壁细胞)----个人改进版
by sssholy （2012-10-22）
1. 边缘孔用无菌PBS充填。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为50000个/ml，每孔加入100ul细胞悬液(每孔5000个细胞)。
注：⑴每次加入细胞都使枪头贴着孔底边缘(最好相同位置)，缓慢加入100ul细胞悬液。孔加入顺序：可从上到下，从左到右依次加入。
⑵为了保证细胞密度均匀，最好每加3-5列细胞混匀一下细胞悬液，避免因重力沉降导致细胞密度不均。
⑶每块96孔板加完细胞后，应拿起板子前后左右水平摇晃几下（勿旋转摇晃），使细胞均匀分散。
⑷一般设6个复孔（B-G行），对照孔非常重要，且变异大，故设2列（2，3列为对照孔），4-10或4-11列为给药孔。
⑸边缘孔用无菌PBS充填， 2-11列均可加入细胞。因为要设置调零孔（即不加细胞孔），所以可将第11列设为调零孔，也可将第12列的无菌PBS孔在第2天加药时改为调零孔。
2. 细胞放入培养箱培养，待贴壁后第二天给药（通常前一天下午或晚上铺板，第2天上午给药）。给药方法：先配好药（用EP管配好药），再拿出96孔板，弃去原有培养液（可不用PBS洗，太麻烦了），加入药物。
注：⑴MTT加药时都是先配药再弃去原培养液，最后加入药物。切勿先弃去原有培养液再配药，因为配药一般要花较长时间，若先弃去培养液再配药会导致细胞无营养液体而死亡。
⑵药物是用母液溶于无血清培养基配成工作液，事先算好对照孔，药物孔，调零孔如何配制，如何设置加药顺序。一般越靠中央的孔变异越小，故最重要的给药孔一般放在最中间，次要孔放边缘，调零孔可用第11或12列。
⑶如果某个给药孔需加入2种药物，一般需要一种药物先预处理1-2h（预处理药物可用Ep管配好后再分别加入各孔），1-2h再加入另一种药物（直接加入各孔）。
3.细胞放入培养箱培养24h（或其他指定时间）。
4. 药物作用结束后，每孔加入20ul---MTT(5mg/ml)，培养3-4h。若药物能与MTT反应，可先弃去原培养液，再加入含MTT的培养液（无血清培养液：MTT=5：1配制）。
注：MTT使用前预先解冻。MTT对光敏感，故一般保存于负20℃，配好5mg/mlMTT后我习惯分装于EP管中。
5.终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150ul---DMSO（DMSO可预先算好所需体积加入15ml离心管中）,37℃温箱孵育10分钟或摇床低速振荡10分钟。之后用酶标仪检测OD—490nm（也有测570nm的）各孔的吸光度(A)值。
6.同时设置调零孔（无血清培养基, MTT, DMSO）,对照孔（细胞，最大浓度的药物溶解介质，无血清培养基, MTT, DMSO）。
7.细胞活力（cell viability）：
细胞活力（cell viability of control）=（药物组A值-调零孔A值）/(对照孔A值-调零孔A值）*100%
药物MTT实验步骤----原版：
......
=====================================================================
新手，想请教楼主几个浅显的问题，1.无血清培养基是否加双抗？
2.对照孔是叫最大浓度的药物溶解介质还是相同浓度的药物溶解介质，我看两处有不同。
3.如果想研究加药时间对细胞的影响，如何设置孔？
谢谢！
vcve (2015-7-11 15:16:48)
QUOTE:
我只谈下个人见解，仅供参考：1.没必要加双抗，因为双抗本身也是药物
2.我们做的对照孔是加最大浓度的的药物溶媒
3.可以设置几块不同的96孔板，分别用药物孵育不同时间（如12h，24h，36h等）再检测
www.1 (2015-7-11 15:17:11)
QUOTE:
那细胞培养所加的完全培养基是否含有双抗呢？新手，不要见怪！1472583690 (2015-7-11 15:17:44)
跟大家分享一下新的实验技术，可完全替代MTT，实验结果稳定，细胞增殖曲线特别漂亮，是我老板刚购进的一台仪器。请看图片：
81192770.snap.jpg
1472583690 (2015-7-11 15:18:02)
13661889.snap.jpg
1472583690 (2015-7-11 15:19:36)
shkudo (2015-7-11 15:19:56)
我想问一下，可以药物和细胞都加进去，培养24h后，直接加MTT进行测试吗？ 如果我要做抗炎实验，可不可以将LPS和药物和细胞一起加入，培养24h,再分别进行NO实验和MTT实验呢？谢谢
vcve (2015-7-11 15:20:35)
=========================================================================
呵呵，这个问题不属于MTT范畴了，加不加双抗依据个人需要，加双抗主要是预防细菌污染
【转帖】药物MTT实验步骤(贴壁细胞)