【讨论帖】昨天听到一个NB的PCR操作

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• vcve (2015-8-03 15:44:57)

  观点一：在PCR的延伸这一步，绝大多数人使用72度，这些人很多是没有搞清楚原理。Taq酶的最适温度是75度，我一般使用68度来延伸，可以提高灵敏度。
  降低温度是可以增加灵敏度，同时也降低特异度呀。
  观点二：如果引物设计合理，可以在40度-60度之间进行引物与模板的退火，而且影响不大。有时我甚至在-20度退火，再拿出来68度延伸，因此可以得到平常不容易扩增到的条带，而且没有非特异性产物。我就是用这种方法来扩增基因，进行病毒的临床检测的。
  根据个人设计的引物，40-60度很正常呀。

• minran_1980 (2015-8-03 15:45:17)

  
  他说设计的引物GC含量30%-50%，长度18bp-23bp。这样的引物的退火温度一般不会低于50度吧？这样较大的降低引物的退火温度，怎么保证退火的特异性？他还在-20度的温度下退过火呢！

• jujuba (2015-8-03 15:45:35)

  
  有些操作，如DGGE很多都是用68度延伸。
  楼主提到的这些方法有无道理和适用性，欢迎大家讨论，加分从优。

• ero11 (2015-8-03 15:45:55)

  
  1，退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度,长度为100～300bp时 个人觉得40～70度之间退火都是可以的。 当然温度太低的话确实是可能会增加非特异性产物，但是这也不上绝对的，如果引物设计的不好的话 温度再高都还是可能有非特异性扩增。不过这些还得根据你的实际情况，每对引物的最佳退火温度都是不相同的，40多度退火是碰见过的，当然20度退火还没有体会过。
  2，延伸 ，我觉得如果片段比较短的话，65度左右延伸都是完全可以的，不超过75度都可以考虑。

• KGZ564 (2015-8-03 15:46:10)

  
  1、其实很多公司都推荐Taq酶最好在68°延伸，效果反而略强于72°，大概72°是个先入为主的印象吧，很多人都倾向于72°，但是68°似乎更好点，不过我一直使用72°，也没见着有多差啊，另外，做qPCR的时候，有时候3步法换成2步法，中间直接省略了退火的过程，都是变性后直接68°延伸，应该来说68°其实是Taq酶最佳的延伸温度吧。
  2、确实，一对好的引物是不需要过多考虑退火温度的，只有比较差的引物才要注意退火温度的高低导致的非特异性扩增，如前所述，在做qPCR的时候很多时候是用68°直接延伸，根本就没有退火的过程，这也说明引物设计的好坏直接影响了退火温度可选择的范围。传统的观念一般认为，引物退火温度要比Tm值低上5°吧，这样的好处就是在这个低5°的温度下退火，可以保证体系里面有远多于50%的引物是处于与模板结合状态而不是处于解链状态，这样会保证更加多的扩增产物吧，不过其实我们在起始的状态加入的引物是完全过量的，在实际使用中完全不需要把退火温度降得这么低，直接在引物的Tm温度下退火，还不是可以得到我们要的目的带。不过这位仁兄反而认为在非常低的退火温度下（比如低于40°）还可以得到要的目的条带，我个人认为这只是特例，原因在于他设计的引物的Tm值实在是太低了，为了保证PCR的灵敏性，必须使用非常低的退火温度，使用高退火温度反而会阻止引物和模板的结合。须知在低退火温度下，非特异性条带的几率是大大提高了，特别是当你使用基因组或是反转的cDNA作为模板时，低退火温度几乎不可避免的导致了严重的非特异性条带的产生，有时候甚至会发生完全是非特异扩增而没有目的片段条带产生的情况。在引物通常是18-24个碱基的情况下，一般通用退火温度是55°，用到50°退火已经是很低的退火温度了，至于低于40°来退火，我觉得只是特例，不能做为普遍一般性在常规PCR中使用，见仁见智吧。

• feixi (2015-8-03 15:46:37)

  以cDNA为模板P的时候，退火温度切不可过低，否则非特异性条带的出现几率会大大增加

• eor (2015-8-03 15:46:52)

  
  真是学习了 小弟刚来 还请各位多指教 -20度引物结合没有影响吗？我想最开始时设计肯定也经过大量实验。68度与72有点差距但可能是c+g比例不同而已。谨此拙见还望赐教。

• 33号 (2015-8-03 15:47:10)

  关键在与引物的设计 引物好的话 扩增的温度是很宽泛的 曾经听一个老师说 他们一般不计算TM值 因为一般的引物在55-65都可以扩出来的！
  我前一段在做RNA干扰 需要在引物上加两个酶切位点 所以引物一共有30多bp,最后鉴定的时候用的单引物扩增（连入了正反义链） 我试了梯度扩增 但是一直都有非特异性扩增 并且还是很严重。
  而在平时做PCR时 可能引物相对好设计一点 只需大概计算一下TM值 一般一次都可以得到特异性条带。
  所以我觉得主要还是在与引物设计！

• dior (2015-8-03 16:02:48)

  观点一：在PCR的延伸这一步，绝大多数人使用72度，这些人很多是没有搞清楚原理。Taq酶的最适温度是75度，我一般使用68度来延伸，可以提高灵敏度。
  观点二：如果引物设计合理，可以在40度-60度之间进行引物与模板的退火，而且影响不大。有时我甚至在-20度退火，再拿出来68度延伸，因此可以得到平常不容易扩增到的条带，而且没有非特异性产物。我就是用这种方法来扩增基因，进行病毒的临床检测的。
  不知道大家有什么看法，总之我是不同意他的观点的。40度甚至更低的温度退火而不影响特异性？反正我不相信。
  ......
  1.
  既然 Taq酶的最适温度是75度，那么为什么用68度呢？用75度岂不是更好？
  是因为 延伸温度太高影响引物和模板的结合吗？
  我用过 罗氏的 expand pcr system 的酶 ，要求用68度延伸，当时就感觉很奇怪，但是还是按照他的protocolzuo做了，效果还可以，不过没有比较和72度的区别。
  2.
  退火温度过低肯定会增加非特异性的条带，而且会消耗过多的引物
  如果 仅仅是为了 p出来目的片段未尝不可，可以回收目的条带就可以了
  灵敏度在一定程度增高的同时，但是特异性肯定要差些，而且有可能p出目的条带很弱的。
  我师兄 从基因组p，因为模版大，肯定有部分引物和模版结合的，非特异性条带很多的。如果非特异性条带大小和目的条带差别大还可以，要是大小相差不大，那就麻烦大了！！！
  再有引物设计的时候有时候可以调整，有时候调整的机会很小的，特别是终止密码子的C端，有时候没有办法调整的。所以说引物设计的好只能是相对而言，看设计引物的目的是什么

• minran_1980 (2015-8-03 16:04:49)

  看了各位战友的帖子了，大家还是觉得低温条件下扩增会引起非特异性条带，这和我们平时积累的知识是一样的，也和很多的实验结果符合。
  和我聊天的那个人声称做过退火温度的测试实验，从20-60度都试过，效果据说差不多，没有非特异性条带生成。他采用较低的退火温度和68度作为延伸温度，可以明显提高他所需要检测的病毒(据说比国内外现行的标准要高)的检测灵敏度。我当时就说怀疑他检测体系的特异性，但他说条带只有一条，就算万一产生非特异性条带，可以通过测序和临床症状加以判断。
  现在看来，也许是他设计的引物特异性极高，在他所使用的体系条件下，在较低温度条件下也没有非特异性条带生成。

• whitesheep (2015-8-03 16:05:20)

  
  观点一：在PCR的延伸这一步，绝大多数人使用72度，这些人很多是没有搞清楚原理。Taq酶的最适温度是75度，我一般使用68度来延伸，可以提高灵敏度。
  观点二：如果引物设计合理，可以在40度-60度之间进行引物与模板的退火，而且影响不大。有时我甚至在-20度退火，再拿出来68度延伸，因此可以得到平常不容易扩增到的条带，而且没有非特异性产物。我就是用这种方法来扩增基因，进行病毒的临床检测的。
  我觉得这些不能一概而论，应该是只有最合适的，没有最好的。
  1 的确很多说明书和老师都建议以72度作为延伸温度，不过罗氏的 expand pcr system 的酶和TOYOBO的 KOD Dash酶建议用68度和74度进行延伸。这说明不同反应体系、地域环境、PCR仪的灵敏性以及引物的设计都影响最合适的延伸温度。个人拙见，以说明书的温度为参考，按-3—+3调整，只有多试才有好的经验。
  个人觉得这个时候降低温度与降低特异性没有关系吧？合适的延伸温度是使酶发挥更好的活性，促进更多的目的基因合成。希望拍砖！
  2退火温度是大家比较烦的一个问题。如果要求不高， 4(C+G)+2(A+T) 正反义总和取平均数，再减5度（初略算法），大多可P出条带。要求高的，你只有多试几个温度，绝对没有一触而就的，除非你的火气相当的好！
  -20度是我没有想到的，没有试过，当然也没经验。

• greenbee (2015-8-03 16:06:21)

  关键在与引物的设计 引物好的话 扩增的温度是很宽泛的 曾经听一个老师说 他们一般不计算TM值 因为一般的引物在55-65都可以扩出来的！
  我前一段在做RNA干扰 需要在引物上加两个酶切位点 所以引物一共有30多bp,最后鉴定的时候用的单引物扩增（连入了正反义链） 我试了梯度扩增 但是一直都有非特异性扩增 并且还是很严重。
  而在平时做PCR时 可能引物相对好设计一点 只需大概计算一下TM值 一般一次都可以得到特异性条带。
  所以我觉得主要还是在与引物设计！
  ......
  
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  我觉得这主要跟靶序列相关，如果靶序列是非常特异的，可能退火温度宽泛点没问题，但是在诊断PCR中，退火温度还是高点好，在保证高灵敏度时还要高特异。

• remenb (2015-8-03 16:09:33)

  退火温度高一些是比较合适的。
  不仅是特异性的问题，当退火温度高的时候，引物的二级结构就显得不重要了。而退火温度的范围，和buffer的成分有很的关系。

• 3N4G (2015-8-03 16:10:05)

  我觉得靶序列非常重要，PCR的难易与之直接相关，别的都是次要的（引物设计，退火温度什么的）

• yes4 (2015-8-03 16:15:07)

  延伸在68度的做法早就不稀奇了，很多人都是这么做的。但是退火温度我觉得此人说法还是不能一概而论，至少很多人在设计一对新的引物来扩增一个新上手的基因时，都作过温度梯度吧？有时候确实梯度范围内扩增效率和特异性差别不大，但是有很多时候，某些温度会出来很多非特异性带的。前者可能确实引物设计得非常好，但有时候并不能设计得那么理想，或者由于很多因素引物设计很受限制，那么花费点时间找一个较好的退火温度还是很重要的！

• xyw5 (2015-8-03 16:15:34)

  我觉得这主要跟靶序列相关，如果靶序列是非常特异的，可能退火温度宽泛点没问题，但是在诊断PCR中，退火温度还是高点好，在保证高灵敏度时还要高特异。
  
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  恩 战友说的有理 我的序列是一段含有正义和反义片段的序列 并且是用单引物扩增 另外这个片段比较长（2000BP） 这些可能都是非特异性扩增的原因！

• october7 (2015-8-03 16:15:50)

  
  只做过最低48度的，扩增100多bp的片段，结果挺好。

• 小明 (2015-8-03 16:16:34)

  观点二：如果引物设计合理，可以在40度-60度之间进行引物与模板的退火，而且影响不大。有时我甚至在-20度退火，再拿出来68度延伸，因此可以得到平常不容易扩增到的条带，而且没有非特异性产物。我就是用这种方法来扩增基因，进行病毒的临床检测的。
  
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  不知道大家有什么看法，总之我是不同意他的观点的。40度甚至更低的温度退火而不影响特异性？反正我不相信。
  我想知道这个大牛为什么要用-20度退火？-20度不会结冰吗？-20度退火跟4度，20度，40度退火区别在哪里？有点吹牛的嫌疑，大家可以思考一下降低退火温度会带来的变化，但不要盲目模仿。

• zhy平平 (2015-8-03 16:20:24)

  我用反转录cDNA作为模板做梯度PCR，在50多度根本就得不到目的片段，全是很亮的非特异性带，在60多度才看到了目的条带，所以我觉得还是要看个人的引物来设退火温度才不会坏事。

• zhihui小新 (2015-8-03 16:20:40)

  
  若模板很长如gDNA,设计引物也可以长一点25bp左右,这时PCR扩增的退火温度就可以高一些如68度.