十九大！看看分子病理领域，未来发展方向！
今天党的十九大召开，习近平大大指出：中国特色社会主义进入新时代，我国社会主要矛盾已经转化为人民日益增长的美好生活需要和不平衡不充分的发展之间的矛盾。想想都觉得高中政治课本过时了，而考研又多了一道大题。然而这些年，医疗领域进展可不止一点！就让我们一起看看这些年，分子病理领域的发展！
其实相对于其他技术而言，中国的分子病理技术发展基本和国外同步。
国内最早的分子病理诊断当首推 20 世纪 80 年代的DNA 原位 杂交。当 时王泊云等用32 P 标记 HBV DNA 作探针， 在组织切片上进行杂交反应， 通过碱基互补原理检测肝炎和肝癌组织中的 HBV 感染。
随后出现的是 Southern 杂交检测 T 细胞受体基因和免疫球蛋白基因重排， 目的是鉴定 T 细胞或 B 细胞的单克隆性增生以早期诊断淋巴瘤。
之后， 随着越来越多的肿瘤相关基因被发现， 一系列用于检测癌基因激活和抑癌基因失活的分子病理技术应运而生， 如 p53 基因突变检测、 K-ras 基因突变检测等。
本世纪初， 肿瘤靶向药物被用于临床， 靶向治疗催生了靶向诊断( 又叫药物伴随诊断) ， 一批用于检测靶向治疗药物靶点的分子病理技术迅速问世， 如 FISH检测乳腺癌 HER2基因扩增、 ARMS 法检测肺癌EGFR 基因突变等。
现在全国省级以上医院、 解放军各总医院、 军医大学教学医院基本上都开展了分子病理诊断。因此， 最近 10 年是分子病理诊断蓬勃发展的时期。
一、分子病理诊断技术
目前， 我国已稳定开展的分子病理技术主要有显色原位杂交、 荧光原位杂交、 PCR、 荧光定量 PCR、基因芯片和 DNA 测序技术。
1.显色原位杂交
显色原位杂交( chromogenicin situ hybridization， CISH) 技术是分子生物学、 组织化学及细胞学相结合产生的一门新兴技术， 是利用核酸分子单链间碱基互补的原理， 将地高辛或生物素标记的外源核酸探针与组织、 细胞或染色体上待测 DNA 或 RNA 互补配对， 结合成双链杂交分子， 通过过氧化物酶或碱性磷酸酶的呈色反应将待测核酸在组织、 细胞或染色体上的位置显示出来。根据探针种类不同可分为 DNA 原位杂交和 RNA 原位杂交。DNA 原位杂交主要用于基因定位、 特异基因( 如病原微生物基因) 检测等； RNA 原位杂交则用于基因表达检测。原位杂交技术的优点是操作简单，可直接定位组织， 价格低廉， 信号稳定， 储存方便， 可做组织学评价， 是目前应用较多的分子病理技术之一。
2.荧光原位杂交
荧光原位杂交( fluorescence insitu hybridization， FISH) 技术基本原理与显色原位杂交相同， 不同之处在于 FISH 是应用荧光素标记的探针与组织细胞中待测核酸反应形成杂交体， 并采用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察信号表达。为了同时检测多个靶位，在荧光原位杂交技术的基础上发展起来一种新技术， 即多彩色荧光原位杂交( multicolor fluorescence in situ hybridization，mFISH) 。它用几种不同颜色的荧光素单独或者混合标记的探针进行原位杂交， 能同时检测多个基因，扩大了 FISH 技术的临床应用。FISH 技术目前主要应用于染色体和 DNA 水平上的病理诊断检测。染色体 FISH 主要检测染色体易位、 缺失、 重复、 变异等； DNA FISH 主要是检测基因突变、 扩增、 易位、 缺失。与原位杂交技术相比， FISH 更加安全、 快速， 特异性好、 定位准确。
3.PCR 技术
PCR 技术是一种在生物体细胞外通过酶促合成特异 DNA 或 DNA 片段的方法。其原理是设计特异引物， 在 Taq DNA 聚合酶催化作用下， 经过高温变性、 低温退火和适温延伸 3个步骤反复循环， 对某一特定模板的特定区域进行扩增， 反应结束后应用凝胶电泳或测序等方法分析产物。因此， 该技术可以直接检测疾病组织、 细胞中是否存在某种病毒 DNA， 同时 PCR技术还是基因突变检测的前期必备技术。
4.荧光定量 PCR
荧光定量 PCR ( real time PCR) 技术是近几年基于普通 PCR 技术发展的一种新技术。它借助荧光信号来检测 PCR产物， 通过荧光染料或荧光标记的特异探针， 对 PCR产物进行标记跟踪， 在扩增过程中， 每经过一次循环， 荧光定量PCR仪就会收集一次荧光信号， 实时检测整个PCR进程。用荧光定量PCR法检测目的基因仅需检测样本是否具有扩增信号即可， 且 PCR反应具有核酸扩增的高效性， 可检测出微小突变。根据探针标记不同可分为 TaqMan 探针法和 AＲMS 法。
5.基因芯片
基因芯片又称 DNA 芯片或 DNA微阵列。其原理是在固体载体( 硅片、 玻片、 硝酸纤维素膜) 上按照特定的排列方式集成大量已知DNA / cDNA 片段， 形成 DNA / cDNA 微矩阵。
基因芯片技术是一门新兴的技术， 由于该技术能在一次实验中自动、 快速、 敏感地同时检测数千条序列， 而且获得的序列信息高度特异、 稳定。根据探针类型分为 DNA 芯片和 cDNA 芯片， 前者用于检测基因突变， 实现肿瘤早期诊断、 判断预后及治疗； 后者用于检测基因表达， 对肿瘤进行发现性分类和预测性分类。
6.DNA测序
应用于分子病理诊断的 DNA 测序技术有直接测序法和焦磷酸测序法。直接测序技术主要是 Sanger 等发明的双脱氧链末端终止法。其原理就是根据核苷酸在某一固定的点开始， 随机在某一个特定的碱基处终止， 产生 A、 T、 C、 G 4 组不同长度的一系列核苷酸， 然后在尿素变性的 PAGE胶上电泳进行检测， 从而获得 DNA 序列。直接测序法是基因突变检测的“金标准” ， 其优点是结果准确， 重复性好， 可检测整个测序范围内已知和未知突变点； 缺点是步骤多， 耗时长， 灵敏度低， 过程不易控制， 在检测已知突变位点方面将逐渐被荧光定量PCＲ 法替代。
二、分子病理临床应用
随着分子病理技术的蓬勃发展， 越来越多的疾病相关分子改变被发现并逐步应用于临床实践中。自 21 世纪以来， 分子病理诊断逐渐受到我国病理学工作者的认可和重视， 并逐步在大医院病理科开展起来， 特别是在遗传性疾病、 感染性疾病、 肿瘤等方面分子病理诊断已取得了长足的进步。
遗传性疾病的诊断与分型
分子病理诊断在遗传性疾病的诊断和分型方面凸显特长， 通过对患者染色体、 基因的检测进行遗传病筛查和诊断， 并可对家族遗传病的发生进行预测。目前， 国内主要通过染色体核型分析、 荧光原位杂交技术、 荧光定量PCＲ 技术等检测染色体畸形， 辅助进行产前遗传性疾病的筛查。通过 DNA 直接测序、 荧光定量 PCＲ、免疫组化技术等检测相关基因的结构、 表达的变化，辅助进行神经系统、 生殖系统等遗传性疾病的诊断。
感染性疾病病原体的检测
在感染性疾病的临床应用方面， 采用原位杂交、 PCＲ-斑点杂交对人乳头状瘤病毒( HPV) DNA 检测， 采用荧光定量 PCＲ技术检测结核杆菌 DNA， 采用 PCＲ 技术检测各型肝炎病毒 DNA 或 ＲNA， 采用荧光定量 PCＲ 技术检测人类单纯疱疹病毒( HSV) DNA、 肺 SAＲS 病毒 ＲNA感染， 采用原位杂交检测 EB 病毒( EBV) 编码的小ＲNA( EBEＲ) 等， 这些检测已在感染性疾病的诊断及对疗效进行评价方面取得了很好的效果。
肿瘤的病理诊断与临床应用
单独遗传因素造成肿瘤的概率 ＜ 5% 。肿瘤的发生主要是遗传基因和环境因素共同作用的结果，其中遗传基因是内因， 与人体是否具有肿瘤易感基因有关。肿瘤易感基因检测就是针对人体内与肿瘤发生、 发展密切相关的易感基因进行的， 它可以检测出人体内是否存在肿瘤易感基因或家族聚集性的致癌因素， 根据个人情况给出个性化的指导方案。
在肿瘤辅助诊断方面，目前在软组织和骨肿瘤、淋巴造血系统肿瘤及肿瘤的分子分型中应用最为成熟。
基因表达谱研究在肿瘤预后评估方面起着巨大的推动作用， 如乳腺癌 21 基因检测预测早期乳腺癌复发风险及化疗获益情况， 14 基因与肺癌的预后。另外， 诸如外周血循环肿瘤细胞的检测与肿瘤的复发与转移等技术也逐步在国内获得应用。
三、分子病理的发展趋势
分子病理学是近十年来病理学的一个最具活力和最重要的发展领域之一。它的发展使病理学登上了肿瘤靶向治疗、个体化医疗及精准医疗的领域。在新技术的不断引进和渗透下， 分子病理学将会从以下三个方面进展。
1.由单一分子靶点到分子组学
治疗 靶 点 检 测: 石 蜡 组 织 或 细 胞 学 样 本 分 析HEＲ-2、 C-KIT、 PDGFＲA、 EGFＲ、 BＲAF、 ALK、ＲOS1、VEGF、CD20、BCＲ-ABL 等基因突变已经成为常规的病理检测项目； 而新的靶点正不断被确定 。通过对治疗靶点、分子分型、组织病理学分级及病理临床分期等方面的深入分析， 病理学检查为确定肿瘤分类与分层治疗提供依据。然而多数肿瘤分子分型或预后因素涉及多个基因改变， 这既是驱动基因突变带来信号通路激活的结果， 也是由肿瘤普遍存在的异质性所致。另外， 部分肿瘤发生具有背景基因突变， 如BＲCA1 /2、MMＲs、P53、PTEN、ＲB 等。肿瘤组织学分级、临床分期也反映基因改变的差异。因此， 分子谱、分子组的检测将成为必然。
2.由静态到动态
近年来， 以二代测序技术为标志的高通量检测技术的普及， 标志着生命科学进入了一个崭新的时代 。二代 测 序、基 因 芯 片、蛋 白 质 组、代 谢 组、NanoString 等高通量分子检测技术使生物医学研究得以进行大量分子同时检测， 结合分子间功能调节的网络效应信息， 促使生物医学进入了组学时代， 即分别包括基因组学、蛋白质组学、转录组学、外显 子 组学、微小 ＲNA 组学、代谢组学、表观遗传组学的全基因组分析的大数据时代。分子组学的兴起催生了生物学领域系统生物学的诞生。病理学界也提出建立系统病理学这一新的方向: 即基于病理形态变化， 以新一代测序技术等高通量分析技术为基础， 整合定性与定量、动态与静态信息， 建立起具有连贯性的模式来阐明疾病和可重复性预测疾病过程以及服务于不同的治疗选择 。
3.由诊断到全程监测
由于非侵入性检查理念和分子病理的进展及高敏感性检测技术的诞生， 如数字 PCＲ 技术、超深度二代测序技术等， 病理学分析材料正不断从依赖活检、切除标本， 向更多利用脱落细胞学和针吸细胞学， 尤其是血液、尿液、脑脊液等体液分子检测， 即液体活检( liquid biopsy) 方面发展。在肿瘤治疗过程中靶向分子的治疗反应、耐药性、继发突变确定， 以及肿瘤转移与肿瘤形成平行发生新理论的要求， 液体活检正在迅速开展， 其检测内容也在不断更新， 从循环肿瘤细胞、循环肿瘤 DNA 到最近确立的肿瘤外泌体、肿瘤修饰血小板的检测， 以及单细胞分析等相关技术也将是病理学发展的一个新的生长点， 期待被广泛应用于疾病的诊断、预后判断、治疗反应预测与疗效评估乃至疾病的易感性评估 。
