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【求助】谁能给讲讲封闭的原理？
【求助】谁能给讲讲封闭的原理？
一直做western，可是不知道BSA具体封闭什么原理。BSA和脱脂奶粉封闭的时候，难道都是和非目的带结合？为什么不和要检测的目的带结合呢？怎么就不封闭目的蛋白呢？希望那个高手能帮我解答一下这个疑惑！
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【求助】谁能给讲讲封闭的原理？
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-5-21 16:12 作者: bamboo16 来源: 分析测试百科网
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xyw5 (2013-5-21 16:14:09)
你可以理解为NC膜或者PVDF膜上有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到了膜上，塞进了很多洞洞里面，但是你也知道，蛋白并不是连续的，有很多空隙，而且比如说样品孔之间也有空隙，这些洞洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样，就会有很多非特异性的信号，但如果用富含蛋白的封闭液与膜作用，那所有的空洞都会被BSA或者酪蛋白填满，这样，抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合
am10 (2013-5-21 16:19:48)
birdfish (2013-5-21 16:33:48)
BSA和脱脂奶粉都可以用作封闭的
一般来说，BSA成份单一，适用于大多数情况，但是价格相对昂贵，而且也据说封闭效果略不如脱脂奶粉
OVA价格就更加昂贵了
脱脂奶粉最大的优点是价钱便宜，所以是首选，但是由于成分相对复杂，所以适用范围要狭窄一些。磷酸化抗体也许会导致背景增加，此外，因为自身含有biotin,不能用于biotin标记的抗体系统。
redbutterfly (2013-5-21 16:37:02)
那如何解释组织免疫组化中用的BLOCKING呢
PINK (2013-5-21 16:37:32)
S6044 (2013-5-21 16:38:18)
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2楼说的形象，让人一目了然。但个人认为并不全面，如果封闭仅仅是填补空隙的话，那封闭仅仅是起到降低背景的作用。如果是这样的话杂带的问题怎么解释呢？还有免疫组化的封闭是怎么个原理呢？个人觉得从抗原决定簇的角度来说可能会更好一点。抗体是识别抗原决定簇，然后与之结合，奶粉和BSA起封闭作用主要是通过蛋白起作用的，就是能够非特异性地将表面的抗原决定簇结合，这样特异性的抗体就不会跟这些非特异性的抗原决定簇结合，这样背景就会降低。可能有人会问，那目的蛋白为什么不能被封闭掉？因为抗体跟目的蛋白的结合是非常特异的，结合能力很强，封闭之后依然能够结合。当然如果封闭是太长，也能影响抗体的特异性结合，导致最后显影信号变弱，这就是有时候封闭时间长了信号变弱的原因。同样，通过延长封闭时间来去除非特性条带以及免疫组化中延长封闭时间降低背景都是这么个原理。
个人拙见，不知道说没说清楚，不对之处欢迎指正
kswl870 (2013-5-21 16:46:42)
QUOTE:
其实现在有商业化western封闭专用的脱脂奶粉，这些奶粉都是蛋白激酶和蛋白磷酸酶失活的，所以做蛋白的磷酸化也是没有问题的。bamboo16 (2013-5-21 16:47:20)
我最初问得就是楼上战友回答的这个问题，我一直觉得block是要把除了目的蛋白以外的蛋白都给封闭掉，没有想过还有膜上的空隙这个问题，这样看来楼上两位的综合起来应该是比较全面。
tuuu2 (2013-5-21 16:48:37)
Western Blott用的膜和蛋白质纯化用的柱类似，都是对蛋白进行了吸附，包括胶电转到膜上的蛋白以及封闭所用的奶粉和BSA等都是对膜的一种吸附。这种吸附作用的机理是包括疏水作用、静电、范德华力等等的综合作用，都是非特异性的。
本人认为，封闭时的封闭蛋白不仅是吸附到膜上的空白位置，而且还会和膜上已有的蛋白（目标蛋白和杂蛋白）产生竞争性的洗脱作用，而不是和膜上的蛋白产生结合作用。即不是用封闭液封闭杂蛋白的非特异性的抗原决定簇（用抗原决定簇这个词不是很妥当，但好理解一些），而是将杂蛋白从膜上部分洗脱下来，从而减轻了非特异性的条带信号。这种洗脱也会对目标蛋白产生作用，同样减轻其条带信号。
楼上的这句话：“当然如果封闭是太长，也能影响抗体的特异性结合，导致最后显影信号变弱，这就是有时候封闭时间长了信号变弱的原因”不能用结合来解释，但用洗脱就比较好理解。抗体与目标抗原的亲和结合常数远远高于这个楼上06战友假说的非特异性结合，即使封闭液中的蛋白可能有与目标蛋白的非特异性结合，在抗体孵育过程中也会完全被替代，而不会影响到最后的显影信号。
用吸附-洗脱假说来看封闭的操作，就能明白为什么封闭液的组成、浓度、时间等等要素的对WB的影响。封闭液中要有可以和膜产生非特异性吸附的分子量适中的蛋白，太大了可能对邻近的目标蛋白产生位置阻碍，太小了容易从膜上的孔洞里脱落。封闭液的pH，盐，表面活性剂等一方面影响封闭液中的蛋白与膜的结合吸附，另一方面还会对膜上的已有的蛋白产生不同洗脱作用，这也是WB中选用不同封闭液的原因，即为了尽可能多的洗脱杂蛋白，尽量减少对目标蛋白的洗脱作用。封闭液的浓度越高，封闭时间越长，对膜上孔洞的覆盖越好，由于竞争性的作用，对杂蛋白的洗脱也越好，但对目标蛋白的洗脱也越强。也就是说在相同曝光条件下背景更干净，杂带更淡，但目标条带也更淡。
owanaka (2013-5-21 17:19:13)
我在用密理博的PVDF膜的时候，它的说明书上说把膜直接放入甲醛中十秒中，然后拿出来晾干，就起到了封闭的作用，可以直接加入一抗孵育了，这又是什么原理呢？
ending (2013-5-21 17:19:33)
没想到平常做的这么一个小操作,还有这么多的原理.有兴趣的童学甚至可以做成一个小课题.
Ao7 (2013-5-21 17:20:25)
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这个是化学法封闭，就是让甲醛和PVDF膜表面的微结构反应或者结合，使之失去结合蛋白的疏水力或者空间结构域
但是根据实际使用情况来看，我们公司每天近百次WB的实验证明，还是用奶粉封闭的效果最好，不过奶粉要挑牌子的，不是所有牌子的奶粉都适宜来封闭
Ao7 (2013-5-21 17:21:36)
至于奶粉封闭的效果为什么比BSA好，我是这样理解的
1，奶粉蛋白种类比BSA多，而WB膜也好，ELISA板也好，表面的微结构都不是那么均匀的，相对而言，不同分子量蛋白种类多的奶粉（BSA只是一种蛋白），封闭起来更全面
2，至于奶粉里的蛋白会不会和膜上已有的蛋白结合，这个要分3种情况（现实中确实也这样复杂）
a,部分奶粉蛋白和“目标蛋白”及“其他转上去的杂蛋白”都结合，但是这种结合是非特异性的，这种情况下，相应的特异性一抗是能竞争过“奶粉蛋白”与“目的蛋白”的结合，同时一抗与“部分奶粉蛋白”+“转上去的其他杂蛋白”的结合体不会有更强的特异性竞争，所以对杂带的封闭有效，杂带不会消失。
b，部分奶粉蛋白和膜和板的空白位置结合，不与“目标蛋白”结合，但是与“转上去的其他杂蛋白”结合，这样也能去掉杂带
c，部分奶粉蛋白只和膜和板的空白位置结合，不与“目标蛋白”及“其他转上去的杂蛋白”结合，这样杂带也依然存在
不知道我这样说，是否好理解
jkobn (2013-5-21 17:22:33)
1、封闭液中的蛋白可以与膜上的空白位置结合。
2、封闭液中的蛋白与膜上的蛋白是一种吸附覆盖作用，无选择性。
3、封闭液中的蛋白与膜上的蛋白是一种吸附覆盖作用，但根据所用封闭蛋白的不同有选择性。
4、封闭液中的蛋白与膜上的蛋白是一种竞争性洗脱作用，无选择性。
5、封闭可以用化学方法，如甲醛封闭PVDF膜。
fei1226com (2013-5-21 17:23:16)
楼上说的都很精彩，借你们的文字和理论，我也自己总结一下，对错与否，恳请赐教。
1、转膜后蛋白以机械填补（堆积）和吸附的方式结合于膜上，这种结合是很牢固的。
2、封闭液中的蛋白可以与膜上的空白位置结合，同样以机械填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在膜上，因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免一抗的非特异结合，所以有“封闭”的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够很牢固的结合在空白位置上。
3、同时，封闭液中的蛋白与膜上的蛋白（抗原决定簇）进行非特异性结合，说明与目的蛋白也是有结合的。但这种结合强度不强，起码比1或2的结合方式要弱得多。
4、不排除“封闭液中的蛋白与膜上的蛋白存在一种竞争性洗脱作用，无选择性”。但应该说这种竞争是很微弱的，因为原来在膜上的蛋白和膜结合得很牢固，这种洗脱作用不至于对膜上蛋白的数量造成实质性影响。
5、一抗和目的蛋白的结合是特异性结合，这种结合力比较强。
6、结合能力比较：1＞2≥5＞3
7、理由：
a、抗体洗脱液可以洗脱抗体，却不能洗脱膜上的蛋白，故2≥5。（另外，洗涤剂如免疫组化的PBS或wetern的TBST无法洗脱2和5、3这三种结合，只是洗去未结合一抗。因为在加二抗前有洗涤，如果能洗脱的话，二抗就会取代被洗掉的蛋白而与膜或其他蛋白产生非特异结合。所以，在封闭后也可洗涤也可不洗涤，但不洗会保险一点，因为在都封闭的情况下，一抗终究会取代封闭液中的蛋白。）
b、1和2有着相同的结合方式，但1的机械填补是在电场的作用下完成的，综合起来认为1＞2。
c、一抗和目的蛋白的结合是特异性的，这种结合在封闭后进行就存在这一抗和封闭液中蛋白对目的蛋白的竞争，但这种竞争很不平衡，因为特异性结合比非特异性结合牢固得多（5＞3），也就是说一抗最终肯定取代封闭液中的蛋白结合在目的蛋白上；但毕竟是存在着竞争，所以一抗的取代不是完全绝对的，还受封闭液的浓度等因素的影响，因此，封闭液的不同会影响一抗和目的蛋白的结合率，也就解释了封闭时间长短，浓度会影响目的条带的现象。虽然这种影响很微弱。
8、最后，结合的强弱都是相对的，非特异条带的出现首要考虑一抗的特异性，其他只是辅助因素，只有衡量利弊，才能有合适的实验方案。
koook5695 (2013-5-21 17:24:02)
转自 pierce western blot（节选1）
88158108.snap.jpg
koook5695 (2013-5-21 17:24:52)
转自 pierce western blot（节选2）
67045167.snap.jpg
hold住 (2013-5-21 17:34:53)
什么牌子的奶粉封闭效果好？我用的最最普通的完达山脱脂奶粉，超市买的，效果感觉也不错啊～
jkobn (2013-5-21 17:35:23)
我们实验室用安怡的脱脂奶粉。
通常当我们要做检测，需要灵敏的时候用 BSA
当我们需要漂亮结果时用脱脂奶粉
eric930 (2013-5-21 17:35:56)
61697434.snap.jpg
【求助】谁能给讲讲封闭的原理？