【求助】蛋白定量方法的哪个好？

最新回复

• DONT (2013-7-26 17:00:21)

  我认为G250方法还没有lowry法可靠，不过用不同的方法还要根据你测的东西不同而定，我以前实验要求不严格，只是大概定一下量所以就用过G-250法，后来用bio－rad公司的蛋白质定量的一个试剂盒，不是很贵，测定方法很简单，就是利用lowry法，你为什么说这种方法过时了呢？我记得上大学时老师们就说G250不如lowry法准确呀。

• 30moonriver (2013-7-26 17:00:48)

  G250很快，可在低浓度蛋白下就不灵光了
  lowry比较麻烦，精度高些
  还有bca法，可信度很高的，不过觉得贵了些。

• moonlight45 (2013-7-26 17:01:45)

  
  其实用那种方法，还要看你的设备，我们实验室的分光光度仪很准确，我做EMSA，测核蛋白，标准曲线的Rsq是0.9998，结果十分稳定。lowry法麻烦了一些。一般的分光光度仪用G250测起来稳定性不好，我也试过，Rsq只有0.8几。

• caihong (2013-7-26 17:02:09)

  G250指的是什么意思

• duoduo (2013-7-26 17:03:06)

  
  G250就是——考马式亮蓝G250染色测定蛋白含量方法——大家简称了

• PINK (2013-7-26 17:03:26)

  
  大家是做实验的，不是写书的，所以在这里讨论才真可得到较为真实的结果。我估计我的原因可能是：我用lowry法时为节省试剂采用减半的办法，标准曲线也挺好。但G250减半就不行了，估计正如楼上战友所说，G250定微量蛋白要差一些，就是说它不如lowry法准确。丁香园万岁！！

• windy+++ (2013-7-26 17:03:50)

  
  G250法也叫bradford法。我们实验室一般都用这方法，要说测微量蛋白，它要比双缩脲法灵敏度要高的呀。作标准曲线时，不妨多取几个点。我测得标准曲线Rsp可以达到0.995以上。

• newway (2013-7-26 17:04:15)

  
  要知道G250法要求是每次测蛋白都得重新做标准曲线的。
  还有，有些去污剂是可以干扰的。

• ending (2013-7-26 17:04:33)

  
  每种方法都是有局限性的，G250和lowry都会受到一些如去污剂或还原剂的影响的，所以要根据具体情况选择不同的方法。

• vera+ (2013-7-26 17:05:03)

  
  也许每个人的试验体会不一样吧。G250法测微量蛋白是不可靠的。但在蛋白含量较高时还可以，我做出来的曲线重复性还是很好的。BCA很贵，操作时也要很小心，因为是微量测定，很小计量的污染都会大大影响测量的结果。

• 6327555 (2013-7-26 17:05:49)

  
  BCA法测蛋白含量能很好的去除如去污剂的影响，灵敏度高，同时它又是lorry的改进方法，是一个很好的测蛋白含量的方法，不过确实贵了点

• 9900 (2013-7-26 17:06:13)

  我需要做大鼠尿蛋白定量，许多人推荐我用考马斯亮蓝方法，我以前没用过这种方法，请教都需要准备哪些东西，在哪里可以下载这个方法的具体步骤以及注意事项？先谢过了！

• 9900 (2013-7-26 17:06:48)

  
  我也是用Lowry法测蛋白浓度。
  哪种方法准，要根据你的蛋白具体来确定，因为Lowry法的原理是酪氨酸在起作用，用的蛋白质标准是BSA，所以它要求你的待测蛋白的酪氨酸与BSA中的酪氨酸残基数差不多的情况下就比较准，所以说哪种方法准要视具体情况而定。

• damingxia0904 (2013-7-26 17:13:37)

  方法   原理   灵敏度(mg/ml)   备注
  Lowry法  碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复合物该复合物随之将磷钼酸磷钨酸还原成蓝色复合物  0.025-0.25  650nm
  G-250染色法  蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化从而改变这些染料的光吸收.考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中为棕红色当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色  0.01-1  595nm
  凯氏定氮法  有机物与浓硫酸共热,有机氮转变为无机氮氨,氨与硫酸作用成硫酸铵,后者与强碱作用释放出氨.借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此过量酸液被中和的程度即可计算出样品的含氮量,再推知蛋白含量  0.2-2  
  双缩脲法在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫红色复合物。蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与铜离子在碱性环境中形成紫红色复合物。  1-10  54Onm
  215&225吸收差法  蛋白质的肽键在200-250nm有强的紫外吸收，且波长越短光吸收越强。若选用215nm可减少干扰及光散射。用215nm 和225nm 光吸收差值可减少非蛋白质成分引起的误差。  0.02-0.1  mg/ml=0.144(A215-A225)
  280吸收法  蛋白质中的W和Y残基的苯环中含共轭双键，在280nm有最大吸收  0.1-1  280nm
  280&260吸收差法  核酸260nm的吸收比280nm强，而蛋白质正相反，  0.1-1
    mg/ml=1.45A280-0.74A260
  可以根据你要求的精度，可信度，结合试剂的价格和操作的难易选择一种就可以了。

• wsll (2013-7-26 17:14:24)

  
  诸位, Bradford 法和 (Coomassie Blue) 考马斯亮蓝G-250 法是一回事么? 我用前者, 简单,快速,灵敏而且不易受其他干扰物质的影响, 用于估计蛋白含量相当不错.

• ladyhuahua (2013-7-26 17:14:50)

  QUOTE:

  原帖由 wsll 于 2013-7-26 17:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  诸位, Bradford 法和 (Coomassie Blue) 考马斯亮蓝G-250 法是一回事么? 我用前者, 简单,快速,灵敏而且不易受其他干扰物质的影响, 用于估计蛋白含量相当不错.

  考马斯亮蓝G—250法于1976年由Bradford建立。所以考马斯亮蓝G—250法又叫 Bradford法。

• qhyu (2013-7-26 17:15:11)

  我们这用G250法感觉好像也不准，提的蛋白用标准曲线算不出，为负值，难道蛋白都跑没了? 不知各位战友用G250法做的结果如何？

• ladyhuahua (2013-7-26 17:15:36)

  QUOTE:

  原帖由 qhyu 于 2013-7-26 17:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我们这用G250法感觉好像也不准，提的蛋白用标准曲线算不出，为负值，难道蛋白都跑没了? 不知各位战友用G250法做的结果如何？

  目前世界上最常用的两种蛋白浓度检测方法：Bradford法和BCA法
  Bradford法（也叫考马斯亮蓝G—250法）测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品中atteb-巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5mM。但受略高浓度的去垢剂影响。需确保SDS低于0.01%，Triton X-100低于0.05%，Tween 20, 60, 80低于0.015%。另外Bradford法是基于酸性溶液的反应。
  BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于0.01%。不适用BCA法时建议使用Bradford法。
  美国FDA批准用BCA法蛋白定量。
  你在实验中要注意比色皿一定要在每次测量后立即用95%乙醇浸泡，然后洗净，再用蒸馏水洗净，不然会影响结果。另外要先测低浓度的样品，后测高低浓度的样品。如果自己测量有问题，那就买试剂盒吧，Bradford蛋白浓度测定试剂盒和BCA法测定试剂盒都有。Bradford法的便宜一点。

• 8princess8 (2013-7-26 17:15:55)

  
  我们是做药品生产检测的,在测定蛋白含量是还是用LOWRRY法的,因为<生物制品规程>就是这样规定的

• 04906 (2013-7-26 17:16:18)

  我需要做大鼠尿蛋白定量，许多人推荐我用考马斯亮蓝方法，我以前没用过这种方法，请教都需要准备哪些东西，在哪里可以下载这个方法的具体步骤以及注意事项？先谢过了！
  
  参见汪家政《蛋白质技术手册》上面说的很详细。其实很多有关生化实验技术的书都有介绍的。