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质谱沙龙第二十二期活动报道

2009.9.02

  2009年8月29日下午,质谱沙龙第二十二期活动在第二炮兵总医院制剂楼举行。除了来自发酵研究院、二炮总医院、空军总医院、北大人民医院的老朋友外,还有来自中国农科院、PerkinElmer公司、北京伯奥克生物技术公司的新朋友。

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 第二十二期质谱沙龙活动现场

 

  生物元素检测方法

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PerkinElmer公司大中华区无机产品线经理 姚继军博士

  首先由来自PerkinElmer公司大中华区无机产品线经理姚继军博士为大家介绍了《生物元素检测方法》的报告。姚博士的报告为沙龙带来了新领域的综述性知识,大家都听得非常专注。

  生物中元素监测的内容和意义

  在我们日常生活中,对人体有害的成分除了一些有机物之外,还有很多无机元素,检测生物的无机元素因此是十分必要的,姚博士在报告中多处引用了美国疾病预防控制中心(CDC)的一些研究。比如他们多年来对使用无铅汽油 vs人体内铅含量的比对研究表面,美国应用无铅汽油后,有效地降低了人体内的铅含量。而在儿童玩具、孕妇产品方面,对有害元素的控制就更严格。在治疗癌症方面,近期还有一种虽然昂贵但有效的捕获疗法,也跟元素含量分析测定有关。在疾病预防诊断方面,不同疾病的抗体可以和特定的元素结合在一起,通过检测这些特定的元素就可以一次检出很多种疾病,这是一种新型的检测方向,检测速度会大大提高。

  任何一种元素对人体是否有益或有害,都不是一个绝对的概念,例如锡(Sn)元素,如果人体缺乏该元素会造成对一些免疫系统机能的损害,但若超过范围即便是超出一点,都会对人体产生有害的影响,所以每种元素在人体内都应存在一个适量的范围,要不断地对其进行监测。

 

  元素的分析方法

  无机元素的检测方法有很多,例如火焰原子吸收、石墨炉原子吸收、原子荧光、氢化物发生原子吸收、垂直直管ICP、水平直管ICP、ICP-MS等。各种方法检测的范围也不同,LC-MS的检测范围可从1ppb到零点几个ppt,火焰原子吸收只能监测到ppm含量的范围。

  不同的仪器方式适合于不同的测量对象,例如监测K、Na、Ca、Mg使用火焰原子吸收就可以了,对人体有害的元素往往需要使用ICP-MS或石墨炉原子吸收。当然具备双向观测功能的ICP光谱可以取代火焰原子吸收的全部功能和一部分ICP-MS或石墨炉原子吸收的功能,例如监测尿液或血液中的Pb含量就可使用ICP,在速度和操作简便上都有所优势。

  姚博士指出ICP实验室是否设计成超净间,取决于所测元素的检出限。超净间和非超净间的区别在于灰尘的含量,灰尘主要含有Cu、K、Na、Ca、Mg这些元素,如需检测< 0.1ppb的上述元素,则需要超净间实验室,譬如半导体试剂和高纯试剂的检测。而对一些检测食品、环境、生物样品的实验室,被测物质本身K、Na、Ca、Mg的含量很高,则无需为超净间。

  元素分析的样品,一定要装在PFA塑料瓶中,而不能装在玻璃瓶中。元素分析的样品可为血液、尿液或头发等各种生物组织,比如对于染色后的头发,首先使用溶剂将其漂洗,之后晾干、称量、消解之后进行检测。血液、尿液样品都可用1%的HNO3稀释后直接进样检测。

 

  ICP-MS:分析能力、仪器结构、工作原理、分析中的干扰

  ICP-MS可以检测所有的金属元素和绝大部分的非金属元素,放射性元素同样可以检测,检出限均可达0.1ppt。检测方法首先利用标准溶液作出标准曲线,由标准曲线便可算出待测物的含量。ICP-MS既能定性分析也能定量分析,质量数的多少代表着元素的种类,信号的高低则代表着含量的高低。

  ICP-MS结构的第一部分为进样系统,通过喷雾使样品进入到分析器里。

  第二部分为射频发生器和接口,射频发生器加热到10000度后,样品里的所有元素都将变成离子。和许多有机质谱的区别在于,该电离过程属于真空外的电离,需要通过两个接口锥将离子引进入到真空系统里。锥外的压强为105Pa,两锥之间为100Pa左右,最终可达到10-7Pa的真空,经过这两个接口锥的经逐级分压作用,最终将离子引入到真空系统内。

  第三部分为离子透镜系统对离子进行聚焦,PE的仪器是聚焦之后通过碰撞反应池(DRC)来消除干扰,消除干扰后的离子再进入到主四极杆,对离子进行筛选,该四极杆和LC-MS、GC-MS的四极杆工作原理是一样的,只是工作的质量数范围不同,对无机元素分析质量数m/z上限到270 amu即可。

  第四部分为真空系统,具备两个涡轮分子泵和两个机械泵,第一个机械泵对两个接口锥之间进行抽真空,第二个机械泵来支撑另外两个涡轮分子泵。

  离子在四极杆内以一定的初速度向前走,同时由于受到负极的吸引所以离子在前进的同时也会向上偏移,当离子接近负极的时候会发生放电而被中和,这些被中和的离子就会被真空泵当作废气抽走。

  由于四极杆的电压随周期在不断地变化,变化的周期对应着特定的质量数,通过不断地变化频率就可把被测离子筛选出来。只有四极杆才能把不同的离子分开,而六极杆和八极杆只能起到离子聚焦的作用,不能过滤离子。

  在ICP-MS检测时各别的离子会存在干扰现象,例如As会受到ArCl的干扰,Cr会受到ArC的干扰,在检测中可通过串接四极杆技术(比如PE的碰撞反应池),离子和特定的气体反应从而消除干扰,同时灵敏度不会下降,之后离子再进入后面的主四极杆,最终进入到检测器。

 

  元素形态分析

  元素形态分析是目前比较关注的研究方向,例如新的矿泉水标准中要求检测溴酸根离子,而不是总溴,因为Br-是无害的,而BrO3-是有害的。其它现在可进行形态分析的还有: As、Cr、Hg、Sb、Se、Sn、Pb、Cu等。检测通过LC-ICPMS联用,或GC-ICPMS联用。比如在LC-ICPMS联用测定四丁基锡时,首先通过液相将元素的各种形态进行分离,之后联用ICP-MS,这里ICP-MS相当于液相的检测器,两者之间存在一个切换阀,通过软件可自动切换,选择是进行样品浓度含量分析、还是形态分析;而对一些易挥发的元素如Sn、Hg,则需要使用气相进行分离。

  元素形态分析今后新的发展方向包括:

  •   研究除As、Se、Hg以外的其它元素,达到多元素形态同时分析;
  •   能够与LC-MS联用进行结构分析
  •   形态分析的应用研究,研究元素形态对人们的生产、生活起到什么样的积极作用,这些信息怎么能够运用到食品加工、工业生产、环境监测等领域里等。

  最后姚博士简单介绍了PE公司,PE公司于1936年由Perkin和Elmer在美国创建,现PE公司产品线包括原子吸收、ICP发射光谱、ICP-MS、微波消解、紫外、红外、荧光、气相、气质、液相和一些蛋白质组学的相关仪器。

 

  SELDI质谱及蛋白芯片技术

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北京伯奥克生物技术公司 李宁工程师

  来自北京伯奥克生物技术公司的李宁工程师,向大家介绍了一种新型质谱技术—SELDI质谱及相关的蛋白芯片技术。

  SELDI被称为表面增强激光解吸电离(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization),该技术基于MALDI技术,是MALDI技术的分支,实质是在进MALDI之前对样品进行纯化,该过程是通过蛋白质芯片技术来实现的。在减少样品前处理、快速筛选标志物、上样量达ng级等方面,都有优势。同时,它可制成很多种芯片。

  蛋白质芯片按用途可分为化学表面和生物表面两大类,化学表面主要用于蛋白质表达剖析,包括:反相疏水、阴离子、阳离子、金属离子以及正相亲水等;生物表面主要用于蛋白质相互作用检测,包括:抗体-抗原、受体-配体、DNA-蛋白质之间的相互作用。

  氨基酸是蛋白质/多肽的基本组成单位,不同的氨基酸除了分子量以外,在等电点、疏水性、带电性上都存在差异。每种蛋白质/多肽的特性通过氨基酸侧链来表达的,例如亲水残基、阳离子残基、阴离子残基、疏水残基、硫氢键残基等,蛋白质芯片就是通过检测氨基酸侧链从而捕获蛋白质信息。

  蛋白质分为一级、二级、三级和四级结构,维持和稳定蛋白质高级结构的物理化学因素包括有范德华力、静电作用、H-H氢键、S-S二硫键等。与传统MALDI技术不同的是,SELDI技术对肽段不进行酶解,检测到的是完整的蛋白。SELDI技术设计之初的目的就是服务于检测粗样品,定位于检测蛋白表达,所以采用了一极线性质谱(TOF)作为检测器,好处是可真实地检测到二三十万个大蛋白。

  该蛋白质芯片由合金制成,在芯片当中有些固定的圆点,这些圆点上面附有聚合物,在聚合物上面再标上各种的化学材料,该圆点被等分为256份,参数一般设置在收集120次以上,基本上就能够把芯片全扫一遍,平均下来出现次数多的证明芯片上含量比较多,出现次数少的样品含量比较低,只作为相对定量分析。

 

  离子型芯片

  弱阳离子芯片(WCX2、CM10、LWCX30)采用羧基基团标配在芯片上,羧基表面本身带负电荷从而捕获带有正电荷的蛋白(例:赖氨酸、精氨酸、组氨酸);结合条件首先要求低PH,至少比蛋白等电点低一个单位,从而保证蛋白带正电荷,其次就是要求低盐,因为盐离子容易产生竞争结合位点;洗脱条件与结合条件相反,即要求增加盐和PH值。

  强阴离子芯片(SAX2、LSAX30)表面标配胺基,其表面本身带正电从而捕获带负电的蛋白(例:天冬氨酸、谷氨酸),结合条件要求至少比蛋白等电点高出一个PH值,还是要求低盐;洗脱条件也同样和结合条件相反,要求增加盐和降低PH值。

  金属离子芯片(IMAC)表面为亚硝酸基,离子常用到的有+2价的Zn、Co、Ni、Cu,该芯片主要结合组氨酸、色氨酸、半胱氨酸和磷酸化蛋白质;结合条件为高盐、PH值为6~8;洗脱条件增加竞争金属络合物,例如增加咪唑、羧基、磷酸盐等。

 

  疏水性芯片

  反相疏水芯片(H4、H50)疏水表面为C16,利用疏水作用或反相的氨基酸前端捕获蛋白,如色氨酸, 颉氨酸, 亮氨酸, 异亮氨酸, 苯基丙氨酸, 胳氨酸;结合条件为高盐、无机;洗脱条件则减少盐和增加有机。

  正相亲水芯片(NP20)采用SiO2氧化硅表面,通过蛋白质的亲水表面相结合,结合条件为缓冲液,洗脱条件为水洗,该芯片不常用,在检测纯品的时候才会用到。

 

  生物化学表面芯片

  生物化学表面芯片分为羟基二咪唑(PS10)和环氧基(PS20)两种,主要通过赖氨酸来结合抗体。操作过程是先拿到干燥的芯片,首先加入缓冲溶液使其环氧基环打开,之后加入抗体,标配好的抗体便会与含有抗原的未知物赋予,赋予以后再加入洗涤缓冲溶液,使没有被结合的物质洗涤下去,最后加入基质。跟其它质谱不同的是通过载片来纯化蛋白,上机时本身就具有蛋白只是把基质附加在上面,而不是先加基质或是基质和蛋白混合物混合在一起。

  SELDI质谱技术基于双向电泳和飞行时间质谱技术,其优势在于,用芯片技术使纯化平台缩减到最小,并大幅提高工作通量,适用于临床标本的筛选工作。SELDI质谱定位于研究粗制样品里的低分子量、低丰度蛋白,达到快速检测蛋白的目的,从而达到临床应用的效果。

  李工程师介绍后,大家提问踊跃。SELDI技术当时是美国赛弗吉公司的独门绝技,在中国大部分用户是医院用户(40余套),但赛弗吉公司的这门技术当时没有用很好的TOF质谱(据说是采用了英国某质谱工厂的OEM产品,分辨率较低),并与其它主流质谱厂商不兼容,因此在技术发展的初期可谓毁誉参半,拥趸者说其在快速筛选、疾病早期诊断方面具有广阔前景;反对者说其可靠性差、芯片价格昂贵等。赛弗吉公司本身也几经波折,其代表处曾一度退出中国市场,后被天美“接管”过,现在又将技术的一部分卖给了Bio-Rad。而北京伯奥克生物技术公司主要由当年赛弗吉公司中国代表处的维修工程师队伍组建,至今仍在持之以恒地为赛弗吉公司以前的SELDI-TOF用户服务,并和国内一些用户一起合作生物标志物发现等方面的课题。

  SELDI技术后,科学家们在蛋白前处理方面还发展了磁珠等技术,但正如国内外大部分科学家所述,蛋白质组学研究将持续发展,人类蛋白质组学计划马上将从启动阶段进入全面实施阶段,但是技术方面还有待突破。李工根据自己的经验也谈到,SELDI技术要想发展,还需在生物标志物发现后期的验证方面做出更多的工作,尤其要解决定量的问题。但无论如何,这项技术对于快速筛选、临床应用方面还是有强大的吸引力。Bio-Rad收购后,是否能完成或更加接近这个目标,是否能让SELDI技术再次成为热潮,还需大家拭目以待。

  报告下载: 《SELDI质谱及蛋白芯片技术》

 

  LC-MS/MS技术在医院急性中毒药物快速筛查工作中的应用及回顾性分析

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第二炮兵总医院药剂科 李鹏飞老师

  最后由第二炮兵总医院药剂科李鹏飞老师为大家带来了《LC-MS/MS技术在医院急性中毒药物快速筛查工作中的应用及回顾性分析》的报告。

  LC-MS/MS技术在医院急性中毒药物快速筛查工作中的应用

  液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)是以质谱为检测手段的色谱技术,具有不可比拟的高灵敏度和选择性,已成为药物代谢和药代动力学研究等现代药学研究领域最强有力的分析工具之一。

  液相色谱串联质谱技术在医院药学工作中的开发和应用是近几年的科研和应用热点,尤其是急性药物中毒筛查方面,国内、外均有大量高质量科研论文发表。

  LC-MS/MS快速多目标筛查中毒药物的技术特点有以下几个方面:同时快速分析三百种化合物;分析时间小于两小时;MRM定量专属性强;自动谱图查询未知毒物。

  质谱沙龙前面几期对该方法进行了报道,这里不再赘述。

 

  LC-MS/MS技术在医院急性中毒药物快速筛查工作回顾性分析

  截止目前,解放军第二炮兵医院已成功完成169例中毒患者的检测(其中2008年完成76例),检出中毒药物包括地西泮、艾司唑仑等抗焦虑药,多塞平等抗抑郁症药,卡马西平等抗癫痫药、对乙酰氨基酚等解热镇痛药以及氯氮平、氟哌啶醇等抗精神病药。其中有部分患者由于家庭纠纷,感情问题等原因服药自杀;而另有部分患者是由于药物滥用、药物蓄积等原因导致药物中毒。

  (一)中毒筛查各年度发生情况统计

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  以上统计图表的结果显示,中毒情况每年呈递增趋势,月份分布显示12月、5月、7月、3月为高发期。分析认为3月和12月分别为春夏、秋冬交接,天气变化较大,中国古语常说“春捂秋冻”的季节,此时节天气变化较大,容易产生和复发各种疾病,加之季节变化带来的抑郁而高发中毒及自杀,因此,中毒筛查病例较多;5月和7月分别为夏初和夏中高温天气,容易发生疾病和中毒。因此,研究结果建议大家应该在3月、5月、7月、12月加强疾病的防护,并对有抑郁史人群加强管理和监督,防止自杀倾向。

 

  (二)中毒筛查患者情况统计

  对169例中毒筛查患者进行统计,其中男患者为65人,占38.46%;女患者为104人,占61.54%。

 

  中毒患者年龄分布情况:

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  自杀中毒患者分布情况:

 

例数

百分比

检出

31

77.50%

7

17.50%

库对比未见相关物质

2

5.00%

  中毒筛查患者的情况可以看出是以女性为主,比例约男性的2倍,中毒筛查患者中自杀中毒中女性比例更大,约占77.50%。

  青年、中年和老年属于高发人群,其中主要分布在20~30岁和41~55岁区间。分析认为20~30岁区间处于事业初期和感情建立期,年轻人中由于感情问题和工作压力易产生中毒自杀事件;41~55岁区间处于“上有老、下有小”,而男女均不同程度进入“更年期”,随着年龄的增长,易产生各种身体疾病。

  综上所述,建议加强女性的身体保健和心理指导;建议加强20~30岁年龄区间人群的心理辅导,建议20~30岁年龄区间人群多进行户外活动,多参加各项娱乐活动;建议41~55岁年龄区间人群应定期体检,防微杜渐,使身体隐患消除于早期。

 

  (三)中毒筛查样本来源统计

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  中毒筛查病例主要以解放军第二炮兵医院为主,其中最主要以急诊为主,约占72%,其次为呼吸内科、神经内科等,建议在相关科室加强中毒急救筛查,疏通流程,提高急救及筛查速度。

 

  (四)中毒筛查病例中毒情况统计

  中毒筛查病例主诉或家属陈述情况统计表明主要以药物中毒、药物自杀性中毒和食物中毒为主,接近90%;中毒筛查检出情况显示仅有57.99%检出中毒,其余42.01%并未检出,分析原因认为:①未检出病例中多数患者往往是由于身体不适怀疑中毒或他人投毒,个别存在精神方面的问题;②本筛查方法分析库为常见300种易中毒药物,并未包含所有药物,有可能存在漏检的情况。

  最后,李鹏飞做了一个总结:通过对中毒筛查各年度发生情况统计结果研究,建议大家应该在3月、5月、7月、12月加强疾病的防护,并对有抑郁史人群加强管理和监督,防止自杀倾向。

  通过对中毒筛查病例患者基本情况统计结果研究,建议加强女性的身体保健和心理指导;建议加强20~30岁年龄区间人群的心理辅导,建议20~30岁年龄区间人群多进行户外活动,多参加各项愉乐活动;建议41~55岁年龄区间人群应定期体检,防微杜渐,使身体隐患消除于早期。

  通过对中毒筛查病例样本来源统计结果研究,建议在急诊、呼吸内科、神经内科等科室加强中毒急救筛查,疏通流程,提高急救及筛查速度。

  通过对中毒筛查病例中毒情况统计结果研究,建议加强艾司唑仑、地西泮、咖啡因、替马西泮、阿普唑仑、劳拉西泮等药品的管理和流通,防止用药过量和自杀性用药。

  本网收录前沿Lab:第二炮兵总医院分析中心

  报告下载:《LC-MS/MS技术在医院急性中毒药物快速筛查工作中的应用及回顾性分析》

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