【求助】 6X His标签蛋白的纯化求助

最新回复

• mamamiya (2014-2-22 17:30:54)

  
  你可以买镍琼脂糖凝胶和镍NTA琼脂糖凝胶５或１０毫升重力流的预装柱即可，需要可以买点咪唑，配缓冲液按说明书做就可以．手工操作．不需要特别的设备．国产或进口的应该都可以．但是一定要有售后服务．

• 66小飞侠 (2014-2-22 17:31:33)

  
  昆虫细胞杆状病毒表达一般是在胞内。
  除纯化之外，蛋白酶降解也是非常重要的。
  建议使用Roche 的 蛋白酶抑制剂 cocktail 来保护蛋白，而且粗样品不要放置，第一时间内尽快纯化。
  cocktail有两种，因为要上镍柱，所以一定要选择不含EDTA的那种。
  好运！

• mingming0638 (2014-2-22 17:33:50)

  
  今天订购了QIAGEN的Ni-NTA Agarose (25ml)，打完折后人民币2362元。以及QIAGEN的Polypropylene Comumns (5ml)，打完折1380元，是不是有点贵啊？
  然后又从生工订购了咪唑，10克要263元。
  还想买些透析袋，但是不知道哪儿可以买到，哪位战友知道的话，烦请告诉小弟一声啊~！

• mingming0638 (2014-2-22 17:34:23)

  QUOTE:

  原帖由 66小飞侠 于 2014-2-22 17:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  昆虫细胞杆状病毒表达一般是在胞内。
  除纯化之外，蛋白酶降解也是非常重要的。
  建议使用Roche 的 蛋白酶抑制剂 cocktail 来保护蛋白，而且粗样品不要放置，第一时间内尽快纯化。
  cocktail有两种，因为要上镍柱，所以一定要选 ...

  谢谢！我也正担心目的蛋白纯化前后的降解呢，我会试试看的。

• huifeng0516 (2014-2-22 17:35:55)

  其实可以试一下GE公司的17524701，5×1ml的预装柱，载量40mg/ml。
  可以再配一根脱盐柱，置换缓冲液或者脱盐用，效果比透析好多了，用注射器就可以用。
  加起来2000块钱左右就可以了。
  也有单独5ml的镍琼脂糖凝胶，只要几百元就可以了。货号大概是17526806

• moonlight45 (2014-2-22 17:36:20)

  
  大家好，最近也要做纯化这方面的工作，但经费比较紧张，预装柱有太贵了，如果单独买镍琼脂糖凝胶和柱子，然后自己装柱，这个是不是会便宜一点呢？大家有知道哪里能单独买到柱子的么？一般的公司都只卖预装柱，或只卖镍琼脂糖凝胶？
  先谢谢大家了！！

• moonlight45 (2014-2-22 17:37:22)

  还有一个问题，镍琼脂糖凝胶是不是可以重复使用啊？
  

• ero11 (2014-2-22 17:38:02)

  
  镍琼脂糖凝胶能重复使用．我见过客户用最高的是３００次．

• gemei0115 (2014-2-22 17:38:57)

  大家好，最近也要做纯化这方面的工作，但经费比较紧张，预装柱有太贵了，如果单独买镍琼脂糖凝胶和柱子，然后自己装柱，这个是不是会便宜一点呢？大家有知道哪里能单独买到柱子的么？一般的公司都只卖预装柱，或只卖镍琼脂糖凝胶？
  先谢谢大家了！！
  
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  完全可以买填料自己装柱，这样比较便宜，也可以重复使用。
  您可以问一下GE
  
  [ 本帖最后由 gemei0115 于 2014-2-22 17:40 编辑 ]

• mingming0638 (2014-2-22 17:43:03)

  大家好，最近也要做纯化这方面的工作，但经费比较紧张，预装柱有太贵了，如果单独买镍琼脂糖凝胶和柱子，然后自己装柱，这个是不是会便宜一点呢？大家有知道哪里能单独买到柱子的么？一般的公司都只卖预装柱，或只卖镍琼脂糖凝胶？
  先谢谢大家了！！
  
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  我听隔壁实验室的同学说，柱子可以对注射器、针筒什么的加以改造而成，听他的意思好像是说，柱子的要求不是太高的，买好镍琼脂糖凝胶就行，当然我想能买到柱子的话总比改造来的好吧。
  我在东胜创新还找到了Novagen也卖填料的，如Ni-NTA His.Bind Resin(树脂)，10ml打折前是1740元，His.Bind resin打折前是10ml 1392元。
  具体可以联系东胜创新以及楼上战友所说的GE试试看。
  

• mingming0638 (2014-2-22 17:44:08)

  
  还有，订购镍螯合树脂一定要提前1个月起订，因为很多公司在国内没有现货，需要从国外进口二来，要3-4周的说，好浪费时间啊。

• jkobn (2014-2-22 17:45:00)

  
  进口的那样也许没现货,因为他们大多要攒够大的单子这样优惠多,所以没现货,对国产的就没这样的问题,其实国产有的也是不错的.无论镍琼脂糖凝胶或镍NTA琼脂糖凝胶不再那么难生产了.所以不想等时间也可以选国内的.

• finger (2014-2-22 17:45:27)

  
  买点填料，自己就能做了，很简单，只是要预防降解，一步纯化很难做到很纯，看你需要了

• mingming0638 (2014-2-22 17:47:41)

  
  NI柱亲和填料对柱子的要求不是很高,用过GE公司的重力柱,操作很方便,推荐!

• zranqi_1 (2014-2-22 17:49:10)

  买点填料，自己就能做了，很简单，只是要预防降解，一步纯化很难做到很纯，看你需要了
  
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  纯化后脱盐时通过减小收集体积（根据你后续的实验要求），这样可能会得到几管纯的样品，且也能保证比较高的浓度。

• mingming0638 (2014-2-22 17:50:16)

  
  最近做脱盐的时候,发现回收率只有50%,是不是样品在低盐环境下不稳定?求助

• 8princess8 (2014-2-22 17:50:58)

  QUOTE:

  原帖由 mingming0638 于 2014-2-22 17:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  最近做脱盐的时候,发现回收率只有50%,是不是样品在低盐环境下不稳定?求助

  那看你选择什么除盐的方法,透析要留意是不是有沉淀,蛋白通常需要有点离子强度才好溶解,不能都去掉盐.如果是过柱子要留意柱子有时候盐浓度低会有非特异吸附,所以也需要点离子强度.

• fei1226com (2014-2-22 17:51:40)

  QUOTE:

  原帖由 8princess8 于 2014-2-22 17:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  那看你选择什么除盐的方法,透析要留意是不是有沉淀,蛋白通常需要有点离子强度才好溶解,不能都去掉盐.如果是过柱子要留意柱子有时候盐浓度低会有非特异吸附,所以也需要点离子强度. ...

  标记的地方我看不懂，样品过脱盐柱时是将目的蛋白和盐分分开了，本来就会低盐的，那么怎样才能“所以也需要点离子强度”呢？

• 8princess8 (2014-2-22 17:53:21)

  
  非特异吸附可以加一步预洗
  电导仪测一下更好

• zhenxin (2014-2-22 17:53:51)

  
  柱子在华美，透析代在鼎国