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【求助】瞬转、稳转?
【求助】瞬转、稳转?
各位大虾:小弟有个问题搞不明白:
书上说: 转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染(永久转染)两大类。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。
我的问题是:瞬转指的是否是用真核质粒载体转染细胞,而稳转即要用病毒质粒转染细胞?跪谢!!!
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最新回复
caihong (2015-8-10 17:39:39)
瞬时转染是指转染之后几天之内检测目的基因的表达情况;
稳定转染是指转染之后用相应的药物,例如G418, Zeocin, puromycin等处理细胞,获得目的基因稳定表达的细胞。一般周期比较长,至少需要6~8周。
稳定转染也可以用真核质粒转染细胞,例如pcDNA3.1+,pcDNA3.1/Zeocin等载体。
用病毒转染细胞后,几天之内检测目的基因的表达,之后不做任何处理的话,也属于瞬时转染。
11_hjx (2015-8-10 17:39:59)
QUOTE:
谢谢大虾,您就是说瞬转不需要药物筛选,可是如果不筛选的话,有的细胞质粒转进去了,有的没有转进去,那我后面测RNA和蛋白不就不准了吗?小弟刚刚开始做这个,望大虾指点,跪谢!!caihong (2015-8-10 17:40:17)
大虾不敢当。
瞬时转染的话,转染效率的确会在批次之间所有差异。有的细胞质粒转进去了,有的细胞质粒没有转进去。同时,随着细胞分裂细胞数的增多,质粒会逐渐丢失。
若只是简单的看一下,目的蛋白在宿主细胞中是否表达以及分子大小,可以采用瞬时转染。
但是瞬时转染有的时候会是假阴性,就是瞬时转染检测不到,但是经过加压处理之后,能获得稳定表达该目的基因的细胞系。
xevin (2015-8-10 17:40:40)
QUOTE:
瞬时转染只是质粒进入了细胞核并表达,由于其不能复制,随着细胞不断变多,平均每个细胞中的质粒数不断变少,效果不断降低,直至消失。稳定转染是在瞬时转染的基础上产生的,由于转入细胞核的质粒有很小的概率整合进宿主的基因组中,所以可以用一些抗生素将这种细胞筛选出来并扩大培养,由于质粒稳定的进入了基因组,所以效果稳定存在。
稳转还是顺转主要还是和实验目的有关,区别是一种基因对细胞短时或是长时的影响,看到的效果可能不同甚至相反。
bs4665 (2015-8-10 17:41:03)
QUOTE:
您好!我最近做“pcDNA3.1-目的基因”载体的瞬时超标达,C2C12、HepG2都做过,转染后6小时换液,再过24小时后收样提取RNA,检测不到超标达,以为是质粒的问题,可是换了其他几个质粒依然没有超表达,这跟假阴性有关吗?到底如何才能得到高的瞬时超标达效果呢,求指点,谢谢
iii_ii (2015-8-10 17:41:27)
QUOTE:
你提取RNA来看蛋白的表达并不是很科学的。RNA只能反映基因转录的情况,RNA有没有被翻译产生蛋白质是检测不到的。一般测定蛋白表达都是用直接的WB或FACS分析,通过抗体检查目的蛋白。结果直接,操作简单,也不容易出错。你怀疑没有表达,建议做一个阳性对照检查转染的效率,用GFP或其它表达过的载体都可以。另外,载体测序也是很重要的,要确定DNA序列没有问题。一般要检查ATG附近的Kozak序列,以及有没有移码,有没有终止子。
bs4665 (2015-8-10 17:41:49)
QUOTE:
因为没有抗体,所以先检一下mRNA水平。DNA序列我确定没有问题,质粒也没有问题,下次做的时候同时转下GFP,谢谢您给的意见okhaha (2015-8-10 17:42:27)
is2011 (2015-8-10 17:42:45)
那人说至少需要6~8周,但我感觉2~3周就做出来了。
吉吉0120 (2015-8-10 17:43:52)
【求助】瞬转、稳转?