【求助】PCR条带太浅，试了很多原因都没有改进

最新回复

• standbyme (2014-10-26 22:14:33)

  
  1. 是不是你的胶染色不行啊，连marker都挺浅的，加大染料的用量试试。
  2. 你PCR几个循环啊，加大循环数试试。
  3. 你也可以直接拿PCR产物回收，用回收后的产物来做模板，继续PCR，这样特异性也会好一些。

• hulu呼噜 (2014-10-26 22:15:03)

  
  还可以啊，不算很弱。你胶配的有问题，没溶解完全，染料多加点。

• milkdog (2014-10-26 22:15:28)

  
  配胶的时候适当延长加热时间，增加PCR循环数，另外PCR产物直接跑胶，适当增加染料用量，拍胶图时适当调高光强度看看。

• boom (2014-10-26 22:15:59)

  QUOTE:

  原帖由 standbyme 于 2014-10-26 22:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  1. 是不是你的胶染色不行啊，连marker都挺浅的，加大染料的用量试试。
  2. 你PCR几个循环啊，加大循环数试试。
  3. 你也可以直接拿PCR产物回收，用回收后的产物来做模板，继续PCR，这样特异性也会好一些。 ...

  胶染色我延长了时间，但是mark亮了，条带还是不亮。pcr我都加到了40个循环，应该不少了吧。我现在主要的问题是：目标条带不亮，引物二聚体严重。我一共做了从54-59（引物TM一个是58，一个是59）度梯度pcr出来结果还是不行。好烦

• boom (2014-10-26 22:16:22)

  QUOTE:

  原帖由 milkdog 于 2014-10-26 22:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  配胶的时候适当延长加热时间，增加PCR循环数，另外PCR产物直接跑胶，适当增加染料用量，拍胶图时适当调高光强度看看。

  我用的是丙烯酰胺做的，我的循环数40个，我也跑过42个，但效果也不好。

• boom (2014-10-26 22:16:44)

  QUOTE:

  原帖由 hulu呼噜 于 2014-10-26 22:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  还可以啊，不算很弱。你胶配的有问题，没溶解完全，染料多加点。

  
  已经很暗了，基本上看不到带。我用的是丙烯酰胺胶做的，以前跑这么大片段都很亮的。

• boom (2014-10-26 22:17:16)

  跑梯度的时候目标条带特别淡，二聚体特别严重。我真不知道该怎么办了

  
  2 (1).jpg

• jiushikeshui371 (2014-10-26 22:17:56)

  
  兄弟，你二聚体严重就说明引物有问题啊，两条引物匹配比跟模板匹配还容易，不能换换引物了吗？

• xevin (2014-10-26 22:18:16)

  
  感觉主要是你的胶有问题，条带都不整齐，还有点拖尾的现象

• nikonun (2014-10-26 22:18:43)

  换引物吧，扩增效率不行

• boom (2014-10-26 22:19:24)

  兄弟，你二聚体严重就说明引物有问题啊，两条引物匹配比跟模板匹配还容易，不能换换引物了吗？
  
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  老板出差去了，说回来文章都得写好。不会设计，今年刚研一。好急

• boom (2014-10-26 22:19:45)

  QUOTE:

  原帖由 nikonun 于 2014-10-26 22:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  换引物吧，扩增效率不行

  换引物是不可行了。老板要求十天做完，只有照一张较好的ps了

• lagua123 (2014-10-26 22:20:03)

  
  胶有问题或者是凝胶成像仪没调好！

• viviwang1987 (2014-10-26 22:20:26)

  染胶时溶液用EB的话可以直接加到微红（肉眼勉强可见），一般10分钟就可以。Marker也并不亮，说明染较并不很好。但是二聚体很多的话很可能是引物设计有问题，建议换引物。
  

• 我佛慈悲 (2014-10-26 22:20:48)

  引物问题，特异性差

• tianmei001 (2014-10-26 22:21:07)

  
  温度，引物浓度，模板浓度

• lagua123 (2014-10-26 22:21:29)

  引物二聚体太严重了

• chengjie79 (2014-10-26 22:22:01)

  
  退火温度再升高点吧，试试62~65.我们有次引物浓度尝试到了68才能扩出来目的带。

• sunbent (2014-10-26 22:22:25)

  
  试一下镁离子浓度看看

• 101010 (2014-10-26 22:22:41)

  
  可以换个胶板试试呀
  估计能起作用