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【分享帖】简并引物设计方法（实际操作步骤）

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2015-6-02 16:52    作者: 一叶    来源: 分析测试百科网

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【分享帖】简并引物设计方法（实际操作步骤）
自己做过一些简并引物，现将我利用生物信息学资源设计简并引物的各个步骤作一个总结，各位战友可将各自的心得体会写下，以便大家交流！！！
一、利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列
因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。
二、对所找到的序列进行多序列比对
将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W，也可在线分析[url][/url]http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ 。其结果入下图所示,所有序列的共有部分将会显示出来。“*”表示保守，“：”表示次保守。
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  • 一叶 (2015-6-02 17:05:30)


    三、确定合适的保守区域
    设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～ 400个aa为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个aa的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是有两个6个aa且两者间距离合适的保守区域。

  • 一叶 (2015-6-02 17:07:01)


    三、确定合适的保守区域
    设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～ 400个aa为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个aa的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是有两个6个aa且两者间距离合适的保守区域。

  • 一叶 (2015-6-02 17:10:59)


    五、对引物的修饰
    若得到的引物为：
    5-NAGSGNGCDTTANCABK-3
    则其简并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度多高不利于pcr。我们可以通过用次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度（有个查密码子偏好的数据库我以前发过大家搜索一下把）。
    最后，这样子设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。

  • bs4665 (2015-6-02 17:13:24)

    楼主您好！请多指点！
    我要用质谱得到的两个肽段设计简并引物和探针：
    一、序列
    肽段1：AHGFLPLTK（9肽）
    肽段2：ATGGSAL（7肽）-本应19肽，取可信度最高的7个氨基酸
    二、用Primer Premier 5 设计的简并引物：
    肽段1
    S 5’ GCN CAY GGN TTY YTN CCN YTN CAN A Tm 70.4
    A3’ CGN GTR CCN AAR ANG GGN RAN TGN T GC% 52
    肽段2
    S 5’ GCN ACN GGN GGN WSN GCN YT Tm 73.4
    A 3’ CGN TGN CCN CCN WSN CGN RA GC% 66.7
    三、请问：
    1、每个N 都用次黄嘌呤代替吗？
    2、直接用物种偏好密码子替代多义碱基吗？
    这是该物种的偏好密码子表：
    Amino Acids Codons
    1 2 3 4 5 6
    AAla Alanine GCC (61.8) GCG (38.0) GCA (16.5) GCU (10.1)
    CCys Cysteine UGC (6.9) UGU (1.7)
    DAsp Aspartic acid GAC (35.7) GAU (19.6)
    EGlu Glutamic acid GAA (26.5) GAG (25.7)
    FPhe Phenylalanine UUC (27.7) UUU (4.6)
    GGly Glycine GGC (54.8) GGU (15.3) GGG (7.9) GGA (5.6)
    HHis Histidine CAC (13.7) CAU (6.6)
    IIle Isoleucine AUC (36.6) AUU (6.6) AUA (1.8)
    KLys Lysine AAG (30.2) AAA (7.1)
    LLeu Leucine CUG (67.3) CUC (12.5) UUG (7.7) CUU (5.8) CUA (1.7) UUA (1.6)
    MMet Methionine AUG (25.3)
    NAsn Asparagine AAC (23.4) AAU (6.2)
    PPro Proline CCG (31.4) CCC (10.2) CCA (4.9) CCU (3.0)
    QGln Glutamine CAG (36.7) CAA (5.3)
    RArg Arginine CGC (36.8) CGU (10.7) CGG (10.3) CGA (4.1) AGG (2.6) AGA (1.5)
    SSer Serine AGC (21.7) UCG (15.2) UCC (10.7) AGU (4.4) UCU (2.5) UCA (2.4)
    TThr Threonine ACC (38.6) ACG (12.0) ACU (3.5) ACA (3.3)
    VVal Valine GUG (41.9) GUC (22.4) GUU (7.9) GUA (6.2)
    WTrp Tryptophan UGG (12.4)
    YTyr Tyrosine UAC (16.3) UAU (5.9)
    STOP UGA (1.9) UAA (0.6) UAG (0.3
    请您帮忙看一下好吗？发帖好几天了无人应助。。导师和同学也都不作这个。。快郁闷死了！
    在线等！

  • 一叶 (2015-6-02 17:15:13)


    1、次黄嘌呤的优点是能和四种碱基很好地配对，并且不降低引物可结合的靶序列的数目。不过次黄嘌呤的价格比较贵，可能要一百一个,如果钱多也无所谓啊，哈哈。
    2、每一个aa对应的密码子都有一个出现的频率，根据你研究的物种的Ala对应有4种可能的密码子 GCC (61.8) GCG (38.0) GCA (16.5) GCU (10.1) ，根据每个密码子出现的频率你可以先从高的试起，比如Ala可以设计为GC(CG)，可能绘出很多条带，可以都割了区测序，关键要多是几次。实在不行建议以亚套方式合成引物库，可以参考《PCR技术实验指南》，科学出版社和张学敏《靶向新基因的克隆策略——理论与方法》军事医学科学出版社
    祝实验顺利！！

  • xevin (2015-6-02 17:15:53)

    请斑竹加分！
    1.次黄嘌呤全部替代不现实阿。若选择性替代N是尽量靠近3‘端还是5’端？
    2.手动设计后怎么对其进行评价和Blast？很多软件只提供特异性引物的评估。
    3.查到了该物种的基因组序列。两个肽段的BLAST都与该物种的一假设蛋白
    同源（尽管得分很低），是否可以利用这一信息进行尝试？
    4.用偏好密码子替代G+C含量偏高。
    5.据您的经验，哪家公司的简并引物和探针合成较好？

  • yizhi (2015-6-02 17:22:04)


    1、I一般替代在3'端，保证了3'引物和模板的结合才能保证pcr的进行。
    2、看看两条引物的3'端有没有互补就行了，你只是要求出带，又不要图片多好看是发
    3、不知道你是基于数目判定他们同源的，如果确实同源肯定要试一试啊
    4、gc高可以尝试td pcr啊
    5、我是在生工合成的
    祝实验顺利！！

  • am10 (2015-6-02 17:30:14)

    楼主，是不是在只知道蛋白质序列或者是氨基酸序列的时候，应用简并引物设计啊？我要做的东西，只在论文上查到了蛋白质序列，却没有基因序列。郁闷中，为什么会这样啊？我们本来打算先用文献公布的引物，先P 出来，然后测序，根据序列再看是不是需要继续p ,可是看到这个帖子，就想问问，是不是可以用简并引物做，谢谢！！

  • ujne (2015-6-02 17:30:31)


    大家好,有谁能告诉我如何查找目的基因和引物?谢谢!

  • S6044 (2015-6-02 17:33:46)

    我来做过兼并引物的设计，谈点粗浅的看法，并推荐个比较好的方法。
    由于引物的简并性的问题，所设计的引物通常简并性过高，导致有效引物利用率降低，PCR产物非特异性增高。虽然减少简并引物长度可以相对减少简并性，但随之而来的问题是引物的Tm值过低，有时不得不设计第二对引物对PCR产物进行二次扩增，即巢式PCR，或者需要与Touchdown PCR相结合使用。与通常设计的简并引物不同，利用CodeHop方法设计简并引物。引物由两部分组成：引物3’端为根据4-5个保守氨基酸设计的核心简并区（3’core region），长度只有11-15个碱基；引物5’端为非简并性夹板结构（5’consensus clamp region）。5’端夹板结构是根据密码子偏向性设计的一致性序列，它最大程度的预测了保守性氨基酸的编码序列，其长度取决于所需的退火温度。这样设计的优点在于既减少了引物的简并度，又提高了引物的退火温度，保障了PCR产物的特异性。标准简并PCR在聚合反应的晚期，随着产物的增多，引物的非特异性结合的现象增多；而CodeHop PCR的晚期，这种现象大为减少。实验结果表明，按这种方法设计的简并引物非特异性扩增减少，是一种快捷方便的简并引物设计方案。其与标准的简并PCR比较见图。
    关于CODEHOP方法，可参见文献
    Timothy MR, Emili RS, Jorja GH, et al. Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers for amplication of distantly related sequenes[J]. Nucleci Acids Reseach, 1998,26(7):1628
    Rose TM, Henikoff JG, Henikoff S. CODEHOP (COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer) PCR primer design[J]. Nucleic Acids Res. 2003;31(13):3763-6.
    人宫颈粘液抗菌机制:抗菌多肽的分离鉴定。李明，潘小玲，王莉莉等。中华医学杂志。2005,85（16）:1109-12
    粗浅的一点经验，多交流！

  • veiwu (2015-6-02 17:34:58)

    我是一个当入门做PCR的,我想请问:使用PP5软件中设计的简并引物,所得到的引物都是软件自动在保守区域寻找到的吗?

  • zzzz (2015-6-02 17:42:23)


    强烈推荐CODEHOP，因为我也是用这个工具成功地扩增出了我的目的基因。测序后发现，我的目的基因在核苷酸水平上与其他任何基因都没有显著的相似性，在氨基酸水平上才有。

  • dior (2015-6-02 17:45:27)


    您好：我是一分子实验的新手。想问一下各位：对于知道某蛋白基因，想PCR扩增出其他物种的蛋白基因，保守序列的引物设计是直接从保守序列的氨基酸序列设计吗？PCR时的引物设计可以从基因比对出保守序列，直接设计引物吗？多谢各位了！！！
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