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【转帖】Caco-2细胞培养的一点重要经验
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这个细胞对生长环境的要求非常之高。除了大家熟知的培养液条件的苛刻外（此不详述，又不懂的可留言问），对生长的空间问题要求比较高。
在每一次传代消化的时候，要消化足够长的时间，要不停地在镜下观察细胞的消化状态。因为这个细胞长的比较厚，所以消化比较困难。需要耐心。而消化的结果应该是保证足够多的细胞都是成单个状态而不是抱团或者成片。对于这一点，常规消化是比较难做到的。所以需要采取点特殊措施，我一般是这样做的：
首先吸干净原培养基，加入PBS洗，至少洗两遍，第二遍可以时间长一点，起到一定浸润作用，然后吸走，加入少量含EDTA的胰酶（以下简称YE）润洗，快速润洗完细胞生长面后吸走，然后加入适量的YE（我个人一般较常用量多加0.5-1ml），进行充分的消化，保持在镜下适时观察。待较多细胞被消化下来悬浮于消化液中，大部分细胞边缘皱缩变清晰后，用吸管吸出消化液入离心管中加入适量培养基，常规离心5分钟左右，离心完毕倾倒上清，加入新鲜培养基吹打均匀，然后置于新的小培养瓶中培养。原培养瓶中加入培养基吹打，细胞吹下来之后，适当多吹打几次细胞悬液以使细胞单个分离均匀。然后分瓶传代，原瓶加入新培养基继续培养。
很关键的一点就是将YE的消化细胞悬液加培养基离心后培养，因为这里面的细胞基本上都是被消化下来的单个单个细胞，Caco-2细胞单个单个的生长会比抱团的生长的好很多。传入新的培养瓶中之后你可以与原瓶进行比较。当然若细胞消化的好的话，这点可以舍弃掉。
提醒;一定要用好的胰酶！这点钱一定得花！
希望对大家有用。
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最新回复
xue258 (2015-6-10 10:53:55)
吉吉0120 (2015-6-10 10:54:29)
bs4665 (2015-6-10 10:54:47)
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谢谢楼主的好经验分享，我们正好也在培养Caco-2细胞，具体是建立一个模拟肠壁渗透的模型，在体外对药物的吸收做一个大致的评估（In vitro permeability study).
关于Caco-2的培养基，我来补充点儿实在的：
-DMEM with 10%FBS, 10mM HEPES, 1% Non-essential amino acids and 2mM L-glutamine.
*DMEM Medium(powder):
GIBCO,Cat No.:12100-046
*HEPES(powder):
SIGMA,Cat No.:H-4034
*Non-essential amino acids:
GIBCO,Cat No.:1140-050
希望对准备养Caco-2的战友有帮助，而且耐心真的很重要．
vvmmoy (2015-6-10 10:56:30)
不错，对很多肿瘤细胞的培养都管用。
jude (2015-6-10 10:58:27)
关键是血清的问题，若用进口的，进行培养还是挺简单的，我门主要使用进行酶的提取，传代时，在显微镜的帮助下，多消化几次，即可。
kulee (2015-6-10 10:58:58)
能否上传一张照片看看啊！？我的细胞铺到transwell里头，21day， TEER只有500多！再继续培养也涨不了多少。。。郁闷啊！是不是细胞不行！？
junhun (2015-6-10 10:59:19)
以下是我们用的Procedure，希望有帮助．
Seeding of 24-well culture insert(day1)
*Pre-incubation of the BD transwell culture system:add 200ul of complete DMEM in each insert and 1ml in each well of 24-well plate.Incubate for 2hours at 37℃.
*Measure TEER in blank inserts before seeding.
*Seed 6x10^4 cells/cm^2 (2x10^4 cells/well) to each insert(in triplicate).
*Incubate the transwell culture system in the 37℃ CO2 incubator.
*Change medium for the transwell culture system every other day contiunously for 21-25days.
Remark:
(1)BD BioCoat (Cat No.354803)
Fibrillar collagen TypeI Insert System 24-Multiwell Insert Plate 1.0 Micron.
(2)MILLPORE
MILLICELL-ERS (Cat No.MERS00001)
补充：我查了实验记录，day1空白的TEER是１００多，day21时大部分的TEER已经达到２０００左右了．
给你做个参考，有问题大家在一起讨论．
veiwu (2015-6-10 11:01:12)
请大家帮忙：如果transwell没有铺基质胶，可否用多聚赖氨酸（爬片时为细胞更好的粘附到片子时用的）代替Matrigel？
ending (2015-6-10 11:01:27)
MXFT supplement 为淋巴细胞无血清培养基的添加剂，厂商 AEC 价格：39339.2 货号：FB00899
zhezhe (2015-6-10 11:02:44)
我养的细胞出现了黑色的物体~~~~~~
请各位大侠急救呀~~~
吉吉0120 (2015-6-10 11:03:11)
QUOTE:
你得具体描述你黑色物体是什么，这个CACO-2细胞是很会分泌一些物质的，看起来脏脏的在培养瓶里，很不爽。这就需要你在传代的时候多洗几次。污染的话一般会变浑浊的，你的知识有可能是分泌物之类的。dog002 (2015-6-10 11:03:27)
你好，我刚开始养人原代的T淋巴细胞，想请教一下具体过程，谢谢指导
tudou85 (2015-6-10 11:05:35)
vvmmoy (2015-6-10 11:06:48)
以下是我们用的Procedure，希望有帮助．
Seeding of 24-well culture insert(day1)
*Pre-incubation of the BD transwell culture system:add 200ul of complete DMEM in each insert and 1ml in each well of 24-well plate.Incubate for 2hours at 37℃.
*Measure TEER in blank inserts before seeding.
*Seed 6x10^4 cells/cm^2 (2x10^4 cells/well) to each insert(in triplicate).
*Incubate the transwell culture system in the 37℃ CO2 incubator.
*Change medium for the transwell culture system every other day contiunously for 21-25days.
Remark:
(1)BD BioCoat (Cat No.354803)
Fibrillar collagen TypeI Insert System 24-Multiwell Insert Plate 1.0 Micron.
(2)MILLPORE
MILLICELL-ERS (Cat No.MERS00001)
补充：我查了实验记录，day1空白的TEER是１００多，day21时大部分的TEER已经达到２０００左右了．
给你做个参考，有问题大家在一起讨论．
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请问这个转运的时候这个胶是必须铺的吗？我们用的是康宁的小室。我们还是第一次做，没什么经验，我一个人在摸索，很多地方都很疑惑。请问可否指教一下
veiwu (2015-6-10 11:08:28)
电阻仪可以不买，能用别人的测几次，找找感觉就行了。caco-2的致密性可以用lucifer yellow或者荧光素等可以被酶标仪检测的染料的跨细胞单层的通透性来评价。比如，在donor侧的待测化合物溶液中加入lucifer yellow或者荧光素，转运实验结束后，检测对侧的lucifer yellow或者荧光素的量。如果有的孔染料的量太高了，这个孔的细胞单层可能是不完整的。
caco-2的致密性还可以用一些低通透性的化合物来衡量。比如阿替洛尔。我们实验室，阿替洛尔的Papp一般小于0.5*10-6 cm/s。如果大于这个值，可能这批细胞的致密性不够好。阿替洛尔在你们实验室的Papp很可能不是这个值，这很正常。只要批次间差别不大就可以了。
个人的一点经验，仅供参考！
bring (2015-6-10 11:10:22)
以下是我们用的Procedure，希望有帮助．
Seeding of 24-well culture insert(day1)
*Pre-incubation of the BD transwell culture system:add 200ul of complete DMEM in each insert and 1ml in each well of 24-well plate.Incubate for 2hours at 37℃.
*Measure TEER in blank inserts before seeding.
*Seed 6x10^4 cells/cm^2 (2x10^4 cells/well) to each insert(in triplicate).
*Incubate the transwell culture system in the 37℃ CO2 incubator.
*Change medium for the transwell culture system every other day contiunously for 21-25days.
Remark:
(1)BD BioCoat (Cat No.354803)
Fibrillar collagen TypeI Insert System 24-Multiwell Insert Plate 1.0 Micron.
(2)MILLPORE
MILLICELL-ERS (Cat No.MERS00001)
补充：我查了实验记录，day1空白的TEER是１００多，day21时大部分的TEER已经达到２０００左右了．
给你做个参考，有问题大家在一起讨论．
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我用的是12well plate。seed 8×10e4 cell/well。肉眼观察，可见颗粒状物质，镜下观察细胞比较密集，但是TEER value 始终上不去，一直是600-700（2k ohmm），单个insert面积为1.12cm^2,所以TEER value应该约是1200k ohmm/cm^2 不知您的2000是什么单位呢！？
qqq111 (2015-6-10 11:10:54)
这细胞好养，但无法去除空泡，随着细胞融合，空泡会明显增多，请老师发个图片给大家吧。
dior (2015-6-10 11:11:24)
对于Caco-2模型来说，可以用纤维胶原蛋白铺板，多聚赖安也可以，有利于生长；同时培养基也有讲究，需要配一些培养添加剂。
请您说的再详细点好吗？
新手上路，多多指教
S6044 (2015-6-10 11:11:48)
文献中说TEER大于200-500不就可以用了吗？我现在的TEER在500多，用苯酚红考察通透性小于
1*10-6，不就证明可以用作转运实验了吗？请问，您那2000多是怎么回事？
S6044 (2015-6-10 11:12:14)
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