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【求助】谁做过Hif1a的WB，能在120KD做出来吗？
【求助】谁做过Hif1a的WB，能在120KD做出来吗？
Hif1a的WB好象特别难做，我试了几次，组织中的核蛋白的Hif1a怎么也在120KD测不出来，谁做过Hif1a的WB啊，能做出来吗
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【求助】谁做过Hif1a的WB，能在120KD做出来吗？
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-5-17 13:48 作者: zhihui小新 来源: 分析测试百科网
最新回复
NBA (2013-5-17 13:48:57)
QUOTE:
可以做cwcwcww (2013-5-17 13:49:16)
能做，我们用的是novus的抗体，非常好。
因为HIF-1a很容易降解，所以提蛋白的时候要注意。
zhihui小新 (2013-5-17 13:49:45)
QUOTE:
确实是这样，请问怎么避免HIF-1a 的降解呐cwcwcww (2013-5-17 13:50:08)
我们做的是细胞，你好像是用的组织
这就不太清楚了
我们组里以前有做过小鼠的HIF-1，但不是取的核蛋白，提的是总蛋白
好像做出来的效果还可以
你们用的是哪家的抗体呢
我们组一直做的是低氧，HIF-1也摸索了很久
现在基本都可以做出来
你可以换抗体试试，我觉得一抗很重要
zhihui小新 (2013-5-17 13:50:35)
QUOTE:
我做的确实是组织中的，而且是提取的核蛋白，一直做不出来，不知你们谁有好的建议吗静夜思 (2013-5-17 13:50:59)
我也和楼主一样很困惑，我用的是santa cruze的兔抗鼠多抗，1：100，HIF1a做不出来，提得是小鼠组织的总蛋白，是否真是一抗的问题还是实验技术问题？请高人指点！
静夜思 (2013-5-17 13:51:20)
我们做的是细胞，你好像是用的组织
这就不太清楚了
我们组里以前有做过小鼠的HIF-1，但不是取的核蛋白，提的是总蛋白
好像做出来的效果还可以
你们用的是哪家的抗体呢
我们组一直做的是低氧，HIF-1也摸索了很久
现在基本都可以做出来
你可以换抗体试试，我觉得一抗很重要
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请问你们做小鼠组织的HIF-1是在120KDa附近跑出来的吗？我的WB结果在100KDa附近有条带，不知是不是HIF-1的条带？十分感谢！
jingling845 (2013-5-17 13:51:50)
因为HIF-1a很容易降解，所以提蛋白的时候要注意。
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我正准备买NOVUS的HIF-1α抗体，你用的是核蛋白吗? 我看说明 推荐用核蛋白
jingling845 (2013-5-17 13:52:31)
因为HIF-1a很容易降解，所以提蛋白的时候要注意。
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我正准备买NOVUS的HIF-1α抗体，你用的是核蛋白吗? 我看说明 推荐用核蛋白
cwcwcww (2013-5-17 13:52:52)
我用的Novus的一抗货号是NB100-105，分子量97。说明书上说可以在100-120之间看见条带。基本上只有一个条带，么有看见过杂带的出现。
使用浓度是1:500-1:1000（细胞）。
细胞用总蛋白和核蛋白都可以做出来。
我们一般是提完蛋白，测完浓度之后就直接做WB的。
现在我们有低氧工作站，都在低氧环境下提蛋白的，不容易降解。
但是以往，我们没有工作站的时候也就这么提蛋白的，也没有什么大问题。注意一些就好。
关于组织我没有经验，因为没有做过。不过以前有一个本科实习生在我们组里做过，效果也可以的。
cwcwcww (2013-5-17 13:53:16)
上样量30ug，转膜 PVDF 0.45的膜 350mA 2h湿转。
抗体4度过夜
大家有什么不清楚的，可以再问哦，很乐意为大家解决难题，哈哈
静夜思 (2013-5-17 13:53:54)
使用浓度是1:500-1:1000（细胞）。
细胞用总蛋白和核蛋白都可以做出来。
我们一般是提完蛋白，测完浓度之后就直接做WB的。
现在我们有低氧工作站，都在低氧环境下提蛋白的，不容易降解。
但是以往，我们没有工作站的时候也就这么提蛋白的，也没有什么大问题。注意一些就好。
关于组织我没有经验，因为没有做过。不过以前有一个本科实习生在我们组里做过，效果也可以的。
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谢谢你的指教，还想问一下Hif1a文献上报道的分子量为120，santa的说明书上更说分子量为130，为什么Novus的说明书认为其分子量为97，差别挺大的，我知道蛋白质经过翻译后修饰等因素影响，细胞和组织中同一种蛋白的分子量会出现变化，有文献说细胞中Hif1a的western 分子量是120，为什么和Novus的差别很大？能解释一下我的困惑吗？ 谢谢！！
zhihui小新 (2013-5-17 13:54:24)
抗体4度过夜
大家有什么不清楚的，可以再问哦，很乐意为大家解决难题，哈哈
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请问你做的胶的浓度是多少啊
bananapeople (2013-5-17 13:54:51)
抗体4度过夜
大家有什么不清楚的，可以再问哦，很乐意为大家解决难题，哈哈
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您好 ，我正在用CST的抗体，还没有做出来，请问您觉得半干转会有影响吗？还有PVDF膜如果是0.2的会有影响吗？谢谢！
cwcwcww (2013-5-17 13:55:19)
大分子的蛋白还是用0.45的膜吧
HIF-1的抗体我用过很多家，我觉得最好的是Novus的
后来实验室就一直用的
CST的我没有试过，没有发言权啊
半干转也没有做过
但是大分子的还是湿转比较好吧
建议你在用我的条件试试
祝好运
zhihui小新 (2013-5-17 13:55:45)
HIF-1的抗体我用过很多家，我觉得最好的是Novus的
后来实验室就一直用的
CST的我没有试过，没有发言权啊
半干转也没有做过
但是大分子的还是湿转比较好吧
建议你在用我的条件试试
祝好运
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请问你做的胶的浓度是多少啊
静夜思 (2013-5-17 13:56:10)
谢谢你的指教，还想问一下Hif1a文献上报道的分子量为120，santa的说明书上更说分子量为130，为什么Novus的说明书认为其分子量为97，差别挺大的，我知道蛋白质经过翻译后修饰等因素影响，细胞和组织中同一种蛋白的分子量会出现变化，有文献说细胞中Hif1a的western 分子量是120，为什么和Novus的差别很大？能解释一下我的困惑吗？ 谢谢！！
zhihui小新 (2013-5-17 13:56:45)
QUOTE:
http://www.novusbio.com/HIF-1-alpha-Antibody-H1alpha67_NB100-105.html?rr=true这是novus对hif1a的解释，“By Western blot, this antibody recognizes bands at 120 kDa representing HIF-1 alpha in induced tissues and cells. ”但是在右边的那个图中，显示hif1a绝对不到120，比97高一点，也就是100左右，我们老板说，他们这些试剂公司的图也是用的客户做的，如果以后发现分子量是错误的，大不了赔点钱
静夜思 (2013-5-17 13:57:21)
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谢谢，那也就是说NOUVUS的抗体质量也不能保证就对，你现在做出HIF1a了吗？用哪家的抗体？
zhihui小新 (2013-5-17 13:57:47)
QUOTE:
我就是用的这家的抗体，在120KD做出了细胞的，却总是做不出组织的，今天再试【求助】谁做过Hif1a的WB，能在120KD做出来吗？