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【讨论帖】Western Blot 常见问题分析
【讨论帖】Western Blot 常见问题分析
1. 在western实验中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，在使用中有什么区别？
选择合适的缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS在PH7.0以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选PBS。
western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根据需要选择合适的浓度。
2. 没有注明可以用来做western blot的一抗，可以用来做western blot吗？
不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于western blotting，因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。
3. 做western每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？
最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。
4. western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF好还是NC膜，如何选择？
PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。 都可以用丽春红染色。具体使用还要参考相关文献。
5. 为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多条带，而且好象都很有规律,为什么?是封闭时间不够吗？做WESTERN必须要内参吗？
一抗、或二抗抗体浓度太高，多克隆抗体本身的非特异性反应，抗体的特异性不强，目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀一致.这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化.所以严格意义上说,内参是必须做的。
6. western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些？用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求？
作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。
做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。
7. 半干转是否要求膜，滤纸，胶同样大小？因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？什么是短路？如何控制和发现短路呢？
可以相等，但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的， 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。
8. Western Blot哪种染色好？
（1） 阴离子染料是较常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。
（2） 胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。
（3） 生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。
9. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？
可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。
10. DAB显色、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理是什么？
DAB显色在辣根过氧化酶的作用能形成一种灰褐色的终末产物，该产物难溶于醇和其他有机溶剂，DAB的氧化还能引起聚合作用，导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色中，酶将奈酚磷酸（底物）水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐（显色原）结合而产生有色的、不溶性偶氮染料。
11. 酶显色与荧光显色之间，各自的优缺点是什么？
免疫酶技术就是用酶(如辣根过氧化物酶)标记已知抗体(或抗原)，然后与组织标本在一定条件下反应，如果组织中含有相应抗原(或抗体)，抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应，这样就可以识别出标本抗原(抗体)分布的位置和性质，通过图像分析并可达到定量的目的。
免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断，但是荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清，免疫酶技术则能克服上述不足，标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法，对石蜡切片标本尤为适用，为免疫病理研究开辟了一条新途径，酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察，免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术，前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应，称为非标记抗体酶技术。
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最新回复
9900 (2013-12-23 16:24:00)
我总感觉过程太长，哪里可以省时?
我说说我的大概过程，不知哪一个环节可以缩短。
提蛋白就不说了
电泳也不说了
然后转膜，1h，半干转
封闭2h
1抗杂交，4度12h以上
2抗，2h
后面就没法省了
另外，一次可以同时上几个抗体，假如蛋白分子量差的比较大，比如200，120，50，35，可不可以一起上
131415 (2013-12-23 16:24:19)
我每次都是用得比较大的滤纸，而且上下两层滤纸肯定是接触了，但是并没有影响我的结果啊
我大大小小作了4，50张膜了
ffaa (2013-12-23 16:28:54)
我总感觉过程太长，哪里可以省时?
我说说我的大概过程，不知哪一个环节可以缩短。
提蛋白就不说了
电泳也不说了
然后转膜，1h，半干转
封闭2h
1抗杂交，4度12h以上
2抗，2h
后面就没法省了
另外，一次可以同时上几个抗体，假如蛋白分子量差的比较大，比如200，120，50，35，可不可以一起上
封闭1h就够了，1抗常温下轻摇孵育1.5h也可以，2抗1h也够了，时间长了背景高，至于一起上几个抗体，这个还是不要省时间了吧，效果肯定不好
mimili_901 (2013-12-23 16:29:15)
好像不是特别严格滤纸必须比膜小，不过我是尽量小，以来避免会短路，二来也省啊
最近我的实验做预试时候背景很浅，没两天真正做上样品背景就很深，找不清原因，一抗可以用多久？几次之后就不能用了么？配一抗要加叠氮化钠么？
ladyhuahua (2013-12-23 16:29:41)
我说说我的大概过程，不知哪一个环节可以缩短。
提蛋白就不说了
电泳也不说了
然后转膜，1h，半干转
封闭2h
1抗杂交，4度12h以上
2抗，2h
后面就没法省了
另外，一次可以同时上几个抗体，假如蛋白分子量差的比较大，比如200，120，50，35，可不可以一起上
封闭1h就够了，1抗常温下轻摇孵育1.5h也可以，2抗1h也够了，时间长了背景高，至于一起上几个抗体，这个还是不要省时间了吧，效果肯定不好
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如果目的蛋白的差得比较大的话，可以根据marker的指示将膜剪开，一次可以都做，省时省力。
idea2011 (2013-12-23 16:30:09)
最近我的实验做预试时候背景很浅，没两天真正做上样品背景就很深，找不清原因，一抗可以用多久？几次之后就不能用了么？配一抗要加叠氮化钠么？
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二抗时间没问题吧，二抗孵育过长会加深背景；封闭时间过短也会加深背景。
不同公司的一抗有不同的要求，根据具体情况看是否要加！
二丫头466 (2013-12-23 16:30:29)
我的滤纸有时候比膜大，目前还没有发现短路情况，也许和电压有关吧！
popo520 (2013-12-23 16:31:53)
请问，我跑胶的时候各个泳道的前沿线总是不齐，该怎样解决啊！
还有跑分离胶和浓缩胶的时间最好是多长时间！
（sds-page 12%）
summerxx (2013-12-23 16:32:12)
其实有个简单的办法保证半干转时不会短路，就是裁膜裁滤纸不切胶。
因为有预染marker，把膜裁到10-15kD大小的宽度，放在胶上要转的蛋白的相应位置，滤纸上下对齐放好。因为有胶在中间阻隔，是不会短路的。
另外这样放还有个好处，就是转膜后可以直接检测转膜效率：有膜和滤纸接触的地方蛋白会转移，否则蛋白依旧留在胶中。转膜完成后将整块胶丢到考马斯亮蓝中染色，染色时间相同，脱色时间相同，因此可以很清楚的对比转膜前后的蛋白浓度。
idea2011 (2013-12-23 16:32:40)
还有跑分离胶和浓缩胶的时间最好是多长时间！
（sds-page 12%）
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浓缩胶50V ，分离胶100V
也可70V跑完全程！
具体时间可根据自己的时间安排相应调整电压。
前沿不齐可能是胶浓度不均匀。
greenbee (2013-12-23 16:33:01)
其实有个简单的办法保证半干转时不会短路，就是裁膜裁滤纸不切胶。
因为有预染marker，把膜裁到10-15kD大小的宽度，放在胶上要转的蛋白的相应位置，滤纸上下对齐放好。因为有胶在中间阻隔，是不会短路的。
另外这样放还有个好处，就是转膜后可以直接检测转膜效率：有膜和滤纸接触的地方蛋白会转移，否则蛋白依旧留在胶中。转膜完成后将整块胶丢到考马斯亮蓝中染色，染色时间相同，脱色时间相同，因此可以很清楚的对比转膜前后的蛋白浓度。
好主意，下次我也这样试一下，我对检测转膜效率感兴趣，我做的湿转，这样做也是可以的吧！
owanaka (2013-12-23 16:33:23)
好帖，谢谢。如果膜最大了比胶大会不会短路啊？最近我一直在做都没做出来不知道是不是这个原因啊？
idea2011 (2013-12-23 16:33:48)
QUOTE:
最好不要这样做，很有可能会造成短路。电流直接从膜上通过，而不经过胶，则蛋白就不会转移到膜上。
改进一下试试吧！
flower-201 (2013-12-23 16:34:09)
短路一说,仅仅是理论上的,实际操作中不可能出现.
实践是检验真理的唯一标准.
mamamiya (2013-12-23 16:34:35)
最好不要这样做，很有可能会造成短路。
电流直接从膜上通过，而不经过胶，则蛋白就不会转移到膜上。
改进一下试试吧！
谢谢!我会改进一下的!对于有人说用整块胶转的湿转可以用吗?能转上吗?
131415 (2013-12-23 16:34:56)
曝光时，显影液和定影液各作用多久？中间需要水洗吗？
idea2011 (2013-12-23 16:35:29)
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这个没有固定值，根据需要，显影的时候，用木夹子夹出来多看几次，当显影浓度适当时，即可取出，进行定影。 显影不能太浓！
any333 (2013-12-23 16:35:58)
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根据荧光强弱来确定胶片在暗盒压片的时间。显影一般3-5分钟就可以了（我一般3分钟），时间太长会增加背景。从显影液中夹出胶片后，最好在蒸馏水里轻轻涮几下胶片，把胶片上残留的显影液洗去一些，这样可以使定影液使用的时间更久，不会那么容易失效。定影液中一般8分钟左右吧，你可以把胶片夹起来看看，要是背景已经全部透明的话，也可以不用放8分钟那么久。不过安全起见，还是放足时间比较好。不然你拿到暗房外后，就会发现胶片透光不均匀，有的地方已经很透明了，有的地方还是半透状态。
另外提醒，显影剂比定影剂更容易失效，当显影剂变深黄时，最好不要再使用，不然可能会使显影失败或者使条带显影很弱。
DNA (2013-12-23 16:36:21)
另外，我基本用手直接拿胶片，当然是戴手套的，夹子用起来不太顺手。显影时看条带的话，如果不是很强不太容易看。
有一个视频，推荐给大家cuturl('http://www.jove.com/index/details.stp?ID=264')
JK.jon (2013-12-23 16:36:53)
可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。
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半干转的情况下有相反意见，湿转没做过甲醇的作用是洗脱SDS，如果甲醇浓度高了，会大大的减慢高分子蛋白的转印速度，我们实验室平时是使用20%甲醇缓冲液的。之前我做过一个实验，用10%和20%甲醇相同转印条件，10%可以坚持出200KD的蛋白，而20%的200KD的蛋白并没有转上去，个人也曾经也10%转印缓冲液成功的做出500KD的的天然蛋白WB，所以想和大哥讨论一下，到底是应该减少甲醇浓度还是增加呢
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