【求助】基因表达量低，但是想做荧光定量

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-10-26 22:25 作者: ##蒙奇奇来源: 分析测试百科网

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【求助】基因表达量低，但是想做荧光定量

设计的引物是跨内含子，但是荧光定量做出来效果很不好，咨询过一些公司的技术，说我的基因表达量低没法进行定量，但是如果不能做实验就要全改了，改不起啊，拜求指点。附上图了，求分析。

目的基因

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SLC34A1.jpg

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最新回复

##蒙奇奇 (2014-10-26 22:26:09)

内参

actin.jpg
wawa (2014-10-26 22:26:30)

目的产物不对啊，引物没设计好么？
mingming0638 (2014-10-26 22:26:49)

目的基因的峰怎么有那么多？特异性不好吧，溶解温度也好高啊，是高GC的么？
u76mp (2014-10-26 22:27:31)

你把目的基因扩增的产物长度加长，理论上，目的基因PCR产物每增长2倍，相同的模板，Ct值会降低1！依次类推。但是这个时候你要对Ct值做一个换算。
viviwang1987 (2014-10-26 22:28:13)

QUOTE:
原帖由 u76mp 于 2014-10-26 22:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

你把目的基因扩增的产物长度加长，理论上，目的基因PCR产物每增长2倍，相同的模板，Ct值会降低1！依次类推。但是这个时候你要对Ct值做一个换算。
可以一试
greenbee (2014-10-26 22:28:39)

有钱的话，做Taq探针
BUK (2014-10-26 22:29:08)

引物特异性不高
changlhsyo (2014-10-26 22:29:24)

用探针来做吧
viviwang1987 (2014-10-26 22:29:46)

我做的这个基因也是表达量低,峰很单一就是峰值太低.现在不知该如何优化体系了,还请你指点一下!

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okhaha (2014-10-26 22:30:22)

楼主的是特异性不好，建议在延伸后增加一步80度5秒左右，此时收集荧光，可以增加荧光收集的特异性。或者重新设计引物，设计后最好Primer Blast比对一下，或者直接改用Taq探针。

楼上，图说明你的PCR扩增效率不高，可以试试优化你的退火温度，反应引物量，以及buffer中的Mg离子。反应液与模板的体积也可做调整。
##蒙奇奇 (2014-10-26 22:31:01)

QUOTE:
原帖由 okhaha 于 2014-10-26 22:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

楼主的是特异性不好，建议在延伸后增加一步80度5秒左右，此时收集荧光，可以增加荧光收集的特异性。或者重新设计引物，设计后最好Primer Blast比对一下，或者直接改用Taq探针。

楼上，图说明你的PCR扩增效率不高，可以试试优化你 ...

谢谢你的建议会根据你的建议做做看
希望以后能继续请教你