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【求助】我提的RNA能做RT吗？
【求助】我提的RNA能做RT吗？
各位好
请教一个问题,我提总RNA后，跑琼脂糖电泳，未经变性处理。可是看来似乎不是特别好。请大家帮我看看这RNA，能做RT吗？？特别是6号带，那可是我自己的血分离的单个核细胞啊。
谢谢
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【求助】我提的RNA能做RT吗？
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2015-8-31 15:35 作者: join 来源: 分析测试百科网
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最新回复
remenb (2015-8-31 15:37:41)
我认为你没有必要跑RNA的电泳 你可以用分光光度计检测RNA的含量和纯度 再来决定是否能作cDNA及PCR。电泳容易降解RNA。
ldh (2015-8-31 15:38:55)
应该能做。不管rna多少都能做。
kulee (2015-8-31 15:39:33)
可以，做northern不大好，但rt可以，难以保证肯定成功
vcve (2015-8-31 15:39:55)
QUOTE:
这位仁兄的看法我不赞同。判断RNA质量如何要从以下二点考虑：1 测含量和 OD260/OD280 判断蛋白是否污染的严重。
2 电泳 ，我认为这是最重要的指标，一是看28S,18S的比例对不对，二是看RNA有没有降解，三是看DNA污染的情况。
RNA是否可用，要看是什么用途，如果只是为了克隆某个基因，那要求可以低些，以上RNA图可用。如果是为了做半定量PCR或定量PCR，那还是要讲究些。
zhezhe (2015-8-31 15:41:05)
，普通琼脂糖的效果就不错，28S与18S的比例还是能看得很清楚，就我的一点经验看，跑电泳时加RNA的量不要太多，时间不要太长，只要都跑出空就可以了。楼主的电泳一定跑了不短的吧，恐怕RNA有降解了吧，还有1，3孔里好像还有东东，是不是DNA污染？不知楼主的RNA纯度怎样，要是没问题的话，我觉得作RT应该是可以的。
本来想贴张我跑的RNA电泳图，可惜图有点大，又没有图片编辑软件，不太会用贴‘图功能，只好算了。祝楼主好运Smile
dog002 (2015-8-31 15:42:02)
理论上，迹量的RNA都可以得到扩增。从你的电泳图来看，应该可以扩增。而且做RT-PCR前，不需做电泳。用微量紫外分光光度计，可以检测含量和纯度。
chengjie79 (2015-8-31 15:45:04)
从该图看,28S和18S均清晰,RNA的质量应该是可以的对于提取的RNA一般需要鉴定质量和纯度这是必须的,虽然电泳比较烦琐
1.紫外分光光度计下记录,OD260/280比值,如果在1.6-1.8,说明RNA质量可以,同时可以对RNA定量,知道提取到的RNA量,这对于进行定量分析很重要
2.此外还需要通过电泳鉴定RNA的完整性,分子克隆推荐的方法是1%甲醛变形琼脂糖凝胶电泳,若28S和18S清楚,比值为2:1,则表示RNA完整,降解的RNA电泳中28S和18S条带消失,且主要的片段集中在18S的前方.在这里推荐一种简单的RNA电泳鉴定法,采用0.5*TAE的1%普通琼脂糖电泳(同常规凝胶)在1*TAE电泳液中电泳效果也很好,只要不是做NORTHERN,可以省却许多麻烦,有兴趣的可以试一下
3.在下面的鉴定就是你的RT-PCR了,如果扩增阳性,那就不用担心拉.
shkudo (2015-8-31 15:45:33)
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胶里什么其他的东西都不加吗？这样不担心RNA会降解吗？请指教。
如果这样真有效果我倒想试一试。
shkudo (2015-8-31 15:47:57)
pengjun82yahoo.com.cn
greenbee (2015-8-31 15:52:19)
做rt的rna有如下要求:
18S和28S要清晰,且后者比前者亮.我感觉你的rna 不是很好,建议重提
莲花白 (2015-8-31 15:54:25)
可以做，但你1、3孔好像有大分子物，象DNA。
我觉得你的RNA跑的挺好的。
试试吧。
baidukk (2015-8-31 15:54:41)
我提了RNA，鉴定也走电泳，1%普通胶，60-70V，10分钟左右观察。降解不明显。
zhezhe (2015-8-31 15:55:01)
我建议不要做电泳的，因为你如果做得是rt-pcr，只需要用紫外分光度计测出rna的质量就可以了，这样决定了是否需要重新提取。。。。。。
remonte (2015-8-31 15:56:25)
我认为降解的问题还在其次，在加样孔有DNA带，好像有DNA污染，如果你接下来做RT-PCR的话，就有问题了，到底是RT后的cDNA的扩增，还是基因组DNA的扩增呢？所以有必要加DNA酶处理，消除DNA。
october7 (2015-8-31 15:56:42)
楼上很多同仁已就你的问题提出了宝贵的分析意见和建议,我看了你的RNA电泳图谱,有以下建议,供你参考:
通过你的RNA电泳图谱,可以看出你提的RNA稍有些降解,如果你的试验对RNA要求不高,扩增的基因表达丰度很高,是完全可以用的.
RNA提的好坏,基本标准:OD260/280比值1.8-2.0,2.0质量最高.电泳图谱28S和18S带清楚,比值为2:1,如28S和18S的比值越小,说明RNA的降解程度越大,如28S和18S带消失,则意味着RNA完全降解,一定要弃之勿用,避免浪费.用1%普通胶,120-150v电用即可观察RNA的完整性情况,不一定非得使用1%甲醛变形琼脂糖凝胶电泳.
总之,高质量的RNA(完整性和纯度)是开展与RNA相关研究的前提和基础,一定要提好RNA!
txwuyan (2015-8-31 15:57:02)
QUOTE:
解释的很清楚阿,我们平常提RNA之后也是跑普通胶,但是无论是普通还是变性,电泳肯定是必须的.gogo (2015-8-31 15:58:22)
请问您提到的0.5*TAE和1*TAE是什么意思，与跑dna 的TAE有何区别？
另外我最近做RT-PCR碰到的困难是：我早上造大鼠脑缺血模型，过12小时也就是晚上十点左右必须取材，我只能将取下的海马和皮层加入裂解液匀浆后
放到负70度冰箱，第二天早上来提RNA。紫外分光光度计下记录,OD260/280比值,只有1.4-1.5,甚至会出现1.3-1.4。但浓度还行300-500ng/微升。
放在冰箱里是不是有影响，我应该注意些什么。
比值低但是浓度高，提示什么，这样的样本能做RT-PCR吗？
恳请指教！！！
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从该图看,28S和18S均清晰,RNA的质量应该是可以的对于提取的RNA一般需要鉴定质量和纯度这是必须的,虽然电泳比较烦琐
1.紫外分光光度计下记录,OD260/280比值,如果在1.6-1.8,说明RNA质量可以,同时可以对RNA定量,知道提取到的RNA量,这对于进行定量分析很重要
2.此外还需要通过电泳鉴定RNA的完整性,分子克隆推荐的方法是1%甲醛变形琼脂糖凝胶电泳,若28S和18S清楚,比值为2:1,则表示RNA完整,降解的RNA电泳中28S和18S条带消失,且主要的片段集中在18S的前方.在这里推荐一种简单的RNA电泳鉴定法,采用0.5*TAE的1%普通琼脂糖电泳(同常规凝胶)在1*TAE电泳液中电泳效果也很好,只要不是做NORTHERN,可以省却许多麻烦,有兴趣的可以试一下
3.在下面的鉴定就是你的RT-PCR了,如果扩增阳性,那就不用担心拉.
dior (2015-8-31 15:58:42)
各位有人认为RNA 18S和28S为1:2才不降解，可能是从书上看的吧，实际操很难达到，并且RNA有物种和组织特异性，有的组织和昆虫的18S和28S并非如此，可能还不是18S和28S。
cbou876 (2015-8-31 15:59:08)
如果我是你我就不作了。大量DNA污染，有破坏和降解。除非是像看家基因一样好扩的，否则我几乎可以联想您做不出来的情况了。
各位有人认为RNA 18S和28S为1:2才不降解，可能是从书上看的吧，实际操很难达到，并且RNA有物种和组织特异性，有的组织和昆虫的18S和28S并非如此，可能还不是18S和28S。
物种差异性我不敢否定，我没有做过，但是提到1:2实在也不是什么难事。 如果你比较愿意出钱用Qiagen就行了。呵呵
此外比例不对不一定是RNAase作用的结果，可能是机械破坏而导致。
milkdog (2015-8-31 15:59:56)
我想请教rna电泳上样多少微升
【求助】我提的RNA能做RT吗？