【求助】为什么蛋白在bio－rad的IEF cell上不聚焦？

最新回复

• fsdd817 (2014-7-02 15:27:06)

  
  蛋白浓度仅为8微克/ml，你的上样量是几微克？这样低的上样量有蛋白点才怪。
  改进： 提高制备样品的浓度。再试试。
  祝你好运！！

• fox_79 (2014-7-02 15:27:28)

  
  8微克/ml？开玩笑吧，这么低的浓度用什么办法测量啊，那算上样量得十几毫升啊，晕！
  用Bradford法或BCA法测量的误差都比这大几十倍，八成你蛋白没提出来。
  建议重新提取蛋白

• KGZ564 (2014-7-02 15:27:48)

  抱歉抱歉 应该是8微克/微升 但是好像也不高唉
  bio－rad的IEF仪器 好像很容易受盐的干扰 我只好提取更高浓度的蛋白
  我正在养细胞中
  请大虾给我个分步提取的裂解液配置方法 还有蛋白提取方法
  让我好好比较一下自己差在哪里
  谢谢！！！

• avi317 (2014-7-02 15:29:13)

  
  8微克/微升还太低吗
  我的比这还低
  点还是有的 不过不多呢
  各位大侠 组织中提蛋白有没啥好招呀

• KGZ564 (2014-7-02 15:29:31)

  
  可是 具体怎么个着手法呢？
  我的导师说 他实验的时候 蛋白浓度是20多微克/微升
  我还差的远啊
  可是分步提取 花费很长时间
  很难避免降解
  怎么办呢？

• KGZ564 (2014-7-02 15:29:48)

  
  又要提蛋白了
  细胞长的很好
  这次提15大瓶！

• glass (2014-7-02 15:30:07)

  蛋白浓度已经够了，银染上样量100ug应该足够了。应该从其他方面找原因。

• yhz1973 (2014-7-02 15:30:27)

  
  分部提取是怎么提呀？

• ukonptp (2014-7-02 15:31:51)

  我用的是分步提取法，裂解液按照bio的试剂盒用自己的药品配置，提出的蛋白大概8微克/ml
  浓度低吗？
  转到第二向时，胶上什么都没有
  银染偶尔会有2-3个点
  郁闷 迷惑
  高手指点一下吧
  不然真不知道怎么毕业了
  我也查了一些文献
  方法类似 但是我为什么没有结果呢
  是什么影响的呢？
  多谢指教！！！
  ......

• ukonptp (2014-7-02 15:32:08)

  你后来怎么解决的阿
  我也遇到了蛋白转二向效率很低的情况

• yonger (2014-7-02 15:32:25)

  要确认你提蛋白的试剂都是电泳纯的，试剂要是纯度太低，直接影响电泳过程

• vivian4123 (2014-7-02 15:32:44)

  
  8ug/uL的蛋白浓度已经相当不错了，银染的话我们的上样量通常在80-100ug。
  你I相IEF的电流是多少？样品中盐离子浓度高吗？有没有用CLEAN-UP试剂盒处理过？如果没有问题。
  那I相转II相时，第一个小时转的功率是5W/GEL，可以明显看到蓝色条带。
  如果你没有看到，可能是
  1. 制备胶聚合得不好，
  2. 胶表面不平，和STRIP没有充分接触
  3. 葡聚糖或其他II相电泳液有问题
  

• wood533 (2014-7-02 15:50:58)

  
  你在I相时正常吗？能看到指示剂移动吗？如果正常，应该是样品处理有问题。不知道我说的对不对，我发现得到的蛋白如果干燥不彻底，很难溶解，致使得到的浓度很低。
  另外CLEAN-UP试剂盒好像没有宣传的那样有效果。
  祝你好运

• 101010 (2014-7-02 15:51:21)

  
  请你将你的样品制备过程,详细说一下. 我觉得你如果电泳没有问题的话,就是样品制备问题了.
  我曾经碰到一个人和你一样, 她是组织样品,用超声波破碎的方法制备样品, 结果什么点也跑不出. 其实应该用匀浆的方法机械破碎. 超声波只能用于细胞样品. 后来她按我说的去做了,就没什么问题了,现在质谱也测完了.
  所以你应该把你的实验过程详细说说

• one (2014-7-02 15:51:37)

  
  如果测到蛋白是8mg/ml的话，应该可以跑出来一些的，你可以先跑sds-page看一下条带，再跑双向。
  还有，考虑一下yahyaguo说的情况，组织样品是不好用超声的