月饼类糕点中黄曲霉毒素B1的测定方法试验
黄曲霉毒素是一种肝脏毒素，对人和许多动物都有极强的致癌性，其中黄曲霉毒素B1毒性最大，致癌性最强。因此，食品中黄曲霉毒素B1的检测是非常重要的。下面介绍的分离及测定黄曲霉毒素的方法——薄层色谱法（TLC）是常规分析中常用的一种重要方法。
一、 原理
样品中黄曲霉毒素B1经提取、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。
二、 试剂
（一） 三氯甲烷。
（二） 石油醚（沸程30℃~60℃或60℃~90℃）。
（三） 甲醇。
（四） 苯。
（五） 乙腈。
（六） 无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水。
（七） 丙酮。
以上试剂在试验时先进行1次试剂空白试验，如不干扰测定即可使用，否则逐一检查进行重蒸。
（八） 苯-乙腈混合液：量取98mL苯，加2mL乙腈，混匀。
（九） 硅胶G：薄层色谱用。
（十） 三氟乙酸。
（十一） 无水硫酸钠。
（十二） 黄曲霉毒素B1标准溶液。
1．
贮备液的制备：精密称取1mg~1.2mg的黄曲霉毒素B1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光，置于4℃冰箱保存。该标准溶液约为10μg/mL。用紫外分光光度计测此标准溶液的最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值，并按下式计算此标准溶液的浓度。
式中：X1黄曲霉毒素B1标准溶液的浓度，μg/mL；A——测得的吸光度值；312——黄曲霉毒素B1的分子量；19800——黄曲霉毒素B1在苯-乙腈混合液中的摩尔消光系统；f——使用仪器校正因素；用c（K2Cr2O7）=0.0004mol/L，c（K2Cr2O7）=0.002mol/L，c（K2Cr2O7）=0.0001mol/L三种溶液，以1cm石英杯，在最大吸收峰的波长（接近350mm）处用硫酸溶液（0.5mL硫酸+1000mL水）作空白，测以上三种溶液的吸光度（A），并按式E=A/c计算平均摩尔消光系数，再按式f=3160/E求出使用仪器的校正因素。若f大于0.95或小于1.05，则使用仪器的校正因素可略而不计。
根据计算，用苯-乙腈（98+2）混合液调到标准溶液浓度恰为10μg/mL，并用分光光度计核对其浓度。
2． 纯度的测定：取5μL（10μg/mL）黄曲霉毒素B1标准溶液，滴加于薄层板上，用甲醇-三氯甲烷（4+96）与丙酮-三氯甲烷（8+92）展开剂展开，在紫外灯下观察荧光的产生：只有单一的荧光点，无其他杂质荧光点，原点上没有任何残留的荧光物质。
（十三） 黄曲霉毒素B1标准使用液：用苯-乙腈混合液准确稀释标准溶液至每毫升相当于0.2μg及0.04μg黄曲霉毒素B1。
三、 仪器
（一） 分光光度计。
（二） 烘箱。
（三） 索氏抽提器。
（四） 电热恒温水浴。
（五） 电动振荡器。
（六） 玻璃板：5cm×20cm
（七） 薄层板涂布器。
（八） 展开槽：内长25cm宽6cm、高4cm。
（九） 紫外光灯：100W~125W，带有波长365nm滤光片。
（十） 微量注射器。
四、 操作步骤
由于月饼类糕点中含有大量油脂，为了使测定结果更准确，必须先除去油脂后再进行测定。因黄曲霉毒素易溶解在油脂中，为了达到既要除去油脂便于测定，又要保证样品中含有的黄曲霉毒素不被油脂带走而造成测定结果偏差。因此，应先将黄曲霉毒素从油脂中“赶”出来，然后再除去油脂。根据黄曲霉毒素不溶在乙醚或石油醚中，而油脂易溶于其中的特性，用乙醚或石油醚除去油脂就可达到目的。
（一） 去油脂
称取20g样品，放入滤纸筒内，筒两端塞以少许脱脂棉，置于索氏抽提器内，在250mL油脂瓶内加入180mL-200mL石油醚，于70℃~80℃水浴上加热回流提取油脂，抽提6h以上。除油脂完毕后，将滤纸筒取出放在瓷盘中避光自燃挥干备用，回收石油醚。
（二） 提取
将滤纸筒内除去油脂后的样品转入250mL具塞锥形瓶中，用6mL水湿润，准确加入60mL三氯甲烷，在瓶塞上涂上一层水，盖严，振摇30min，加入12g无水硫酸钠脱水，静置30min以上，用快速定性滤纸过滤于100mL具塞锥形瓶中，取12.00mL
滤液（相当4g）样品）于蒸发皿中，在65℃水浴上于通风柜内挥干，然后放在冰盒上冷却2min~3min后，准确加入1mL苯-乙腈（98+2）混合液。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取下，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中盖严备用。
（三） 测定
1． 薄层板的制备
称取约3g硅胶G，加入2~3倍左右的水，涂成5cm×20cm的薄层板三块。在空气中干燥约15min后，置100℃活化2h。
2． 点样
在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距约为1cm，点直径约3mm。在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下：
第一点：10μL（0.04μg/mL）黄曲霉毒素B1标准使用液。
第二点20μL样液。
3． 展开与观察
在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10mL丙酮-三氯甲烷（8+92），展开10cm，取出挥干后在365nm紫外光下观察结果。如果第二点在与第一点相同的比移值位置上无蓝紫色荧光点，表示样品中黄曲霉毒素B1含量在5μg/kg以下；如在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需进行确证试验。
4． 确证实验
于薄层板左边依次滴加两个点。
第一点：10μL（0.04μg/mL）黄曲霉毒素B1标准使用液。
第二点：20μL样液。
于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min（热风温度低于40℃），再于薄层板上滴加以下两个点。
第三点：10μL（0.04μg/mL）黄曲霉毒素B1标准使用液。
第四点：20μL样液。
再展开（见上3）。在紫外光灯下观察，在黄曲霉毒素B1标准点的相同位置上，样液也出现蓝紫色荧光点为阳性，否则为阴性。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。
5． 稀释定量
样液中的黄曲霉毒素B1荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素B1标准点的最低检出量（0.0004μg）的荧光强度一致，则样品中黄曲霉毒素B1含量即为5μg/kg。如样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一至致为止。滴加式样如下：
第一点：10μL（0.04μg/mL）黄曲霉毒素B1标准使用液。
第二点：根据情况滴加10μL样液。
第三点：根据情况滴加15μL样液。
第四点：根据情况滴加20μL样液。
6． 计算
式中：X2——样品中黄曲霉毒素B1的含量，μg/kg；V1——加入苯-乙腈混合液的体积，mL；V2——出现最低荧光时滴加样液的体积，mL；m——加入苯-乙腈混合液溶解时相当样品的质量，g；0.0004——黄曲霉毒素B1最低检出量，μg。
五、 总结及注意事项
（一） 本实验只有在实验室内没有挥发性试剂时，才能进行操作。或者在点样（只能暴露点样面积）时及展开并干燥以后，在薄层板的上面放1块洁净的玻璃板保护吸附层。
（二） 薄层板在暴露于紫外光之前要始终保持干燥。当吸附剂表面接触太阳光或荧光灯的紫外光线（尤其是存在溶剂）时，紫外光级催化所检验的化合的发生变化。为了显色，要避免未展开的斑点接触紫外光线。
（三） 如环境比较潮湿，薄层板的活性易降低，将影响测定的灵敏度。因此，应在使用当天活化，且点板也宜在有硅胶干燥剂的展开槽内进行。
（四） 由于黄曲霉毒素B1剧毒并强致癌，操作时应特别小心，注意防护及清洗消毒。受污染的器皿，经次氯酸钠溶液（5%）浸泡片刻后再清洗干净即可达到去毒效果。
