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【转载】【讨论】transwell肿瘤侵袭实验的吉姆萨（Giemsa）...
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参阅论坛里关于吉姆萨染色的帖子，自撰一protocol如下，恳请园里战友指正。
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1.迁移24h-48h后，弃去滤膜上、下室的培养液（可直接倒掉，也可用移液器）；
2.在上、下室移入同样体积（上室100μl，下室600μl）的预热的PBS，轻轻吹打PBS达到清洗滤膜下表面的作用，可重复1次；
3.在下室移入4%多聚甲醛600μl，使滤膜下表面浸在其中固定细胞，15min；
4.弃去固定液，倒置transwell小室，使滤膜下表面朝上，自然风干；
5.风干后直接在倒置的transwell小室的滤膜下表面滴上数滴吉姆萨染液，10min；
6.蒸馏水清洗一遍，用棉球擦去上表面未迁移的细胞，在倒置显微镜下观察计数。
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附：本实验使用的是24孔板，以上步骤应该有不足之处，请战友批评指正，不胜感激！！
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最新回复
dmg (2014-8-01 21:19:06)
伊莎贝拉 (2014-8-01 21:19:38)
QUOTE:
我是看到论坛里有战友分享是染色后再擦去上表面细胞，我想是不是未固定擦去细胞会不会影响下表面细胞？期待更多意见！zbboom (2014-8-01 21:20:08)
应该先擦去上室未侵袭或迁移的细胞，否则固定后再擦，难度增大，也有可能擦不干净，用棉签轻轻擦拭，不会影响下表面的细胞；
另外，我们将transwell的膜用刀完整的切下，放在载玻片上加上盖玻片制备成片子永久保存，也方便计数。
leifengta (2014-8-01 21:20:28)
伊莎贝拉 (2014-8-01 21:21:00)
QUOTE:
看了你的问题，我觉得你也是在做transwell实验，而且是侵袭实验，以后多多交流啊。至于小室重复利用问题，论坛里有讨论过的，我觉得下面方法不错：用胰酶浸泡+酒精浸泡+再蒸馏水冲洗，超净台风干，使用前内室面紫外线照3小时，外室面照6小时，如果有超声冲洗可能效果更好。
伊莎贝拉 (2014-8-01 21:21:42)
补上昨天的染色结果（附图）
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个人感觉穿过去的细胞染色较浅，且轮廓不清，影响计数，估计跟Giemsa染液放置太久有关，2002年配制的，此外，染色时间有必要延长至30min，请大家批评指正：
伊莎贝拉 (2014-8-01 21:23:20)
再补上今天的实验结果吧，新配的Giemsa染液效果很好，见附图，实验目的也基本达到，很是开心。此外也补充一下这次摸索的心得吧：
1.关于Giemsa染液配制
Giemsa染色一定要新鲜配制的工作液，因为本人上午配制的工作液上午即时染色效果很好，到晚上做不同时段的染色效果明显降低。建议是Sorensen缓冲液：Giemsa原液9:1配制。
Sorensen缓冲液配制方法为1/15M Na2HPO4 + 1/15M KH2PO4，比例不同PH值不同，建议6:4或者5:5的比例，PH值大约为6.8-6.9，具体参照常用缓冲液的配制，网上一搜就有。
Giemsa原液的配制，我的经验（0.5gGiemsa粉末+22ml甘油+33ml纯甲醇）：取0.5gGiemsa粉末放在研钵里，加上甘油一起研磨，研磨一段时间后再加点甘油，直到混合液成糊状，不见颗粒，最后把总共的22ml甘油加进去搅匀，放在56℃烤箱2小时（注意：因为是烤箱，记得研钵用锡箔纸包裹以防蒸发），2小时后加入33ml纯甲醇，混匀后放在棕色瓶中4℃冰箱保存，可长期保存，网上不少资料建议保存至少一周后使用，我因为赶时间，保存3天就用了，效果如图。
2.关于固定染色步骤
温箱里取出transwell培养板后，先用预热37℃的PBS淋洗小室，别冲洗，这个时候可以先用棉签擦去上室未迁移的细胞（固定后擦除也可以，本人都试过了可行），然后在24孔板里每孔加入4%多聚甲醛约1ml，再放入小室，使小室滤膜浸泡在固定液里（这里也可以在小室内加入数滴固定液，记得避免下室有气泡存在），固定15-20min，取出小室，再次用PBS淋洗，放在桌台上风干，最后在孔板里加入新鲜配制的Giemsa工作液，每孔约800μl（以浸没小室滤膜下表面为度，小室内亦可滴入数滴染液），染色15-20min，蒸馏水冲洗，拭去小室滤膜内面多余染液，镜下观察计数。
先说这么多了，祝大家好运！！！
xueyouzhang (2014-8-01 21:23:49)
DDD (2014-8-01 21:24:13)
请问各位，关于染色的方法，能用其他染料嘛？比如伊红，苏木素，抑或是HE？
伊莎贝拉 (2014-8-01 21:24:42)
QUOTE:
当然行，建议多看看外文报道的染色方法，适当借鉴一下就是……ladyhuahua (2014-8-01 21:25:04)
楼主，用棉签擦除膜上细胞这一步骤，是将膜剪下来再做的，还是直接用棉签在小室上擦除。
如果不剪下来，会不会擦除不干净？
谢谢。
youreyes (2014-8-01 21:25:40)
如果不剪下来，会不会擦除不干净？
谢谢。
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直接擦除。我的步骤是：1.取出小室；2.擦除上室细胞；3.PBS清洗；4.固定；5.染色。
剪下来擦估计会影响下室的细胞，不会擦不干净，我用的是化妆用的棉签。
ladyhuahua (2014-8-02 09:29:12)
QUOTE:
我今天擦细胞时发现细胞都被擦到小室的边缘去了，结晶紫染色后形成一圈紫色的环。用力太大有担心把滤膜捅破了。请问大家擦细胞有什么技巧啊？
紫烟 (2014-8-02 09:30:08)
我用的是BD的transwell，滤膜还是比较牢靠的，反复使用几次，没有捅破的，小心一点就是。
831226 (2014-8-02 09:30:39)
我也染过transwell,感觉这个实验还是相对比较好做的~~ 附图（看到很多人给我发信问怎么染色的，这里补充说明一下，是用伊红染色的，步骤是先用多聚甲醛固定，固定之后再用伊红染色，染完色之后用棉花把上层细胞轻轻擦掉，注意不要把膜弄破，然后放点PBS去照相，注意不要让细胞干燥）
83825922.snap.jpg
yayya (2014-8-02 09:32:58)
blueflyer怎么做的这么漂亮啊！我个人感觉穿过去的细胞是没有清晰轮廓的啊！请教你是怎么操作的啊，还有上层细胞是怎么搽的这么干净的呀？
u76mp (2014-8-02 09:33:19)
图片很漂亮，请问blueflyer是用结晶紫染的吗？是不是做的侵袭实验，急等赐教！
婴儿脸 (2014-8-02 09:33:37)
相关疾病：
肿瘤
楼主，我也需要做这个实验，但我养的是悬浮的细胞，请问悬浮细胞能不能做肿瘤侵袭实验？做的方法有没有什么不同？
dodoit (2014-8-02 09:33:57)
相关疾病：
浆细胞白血病
和楼上的同样的问题，白血病细胞系的悬浮细胞，能不能做侵袭实验，跪请楼主指教
junhun (2014-8-02 09:36:17)
我想请问大家在小室上层铺的都是什么包被液，Fibronection，胶原，Matrigel还是其他的东西，浓度和体积大概是多少？
还有请教一个问题，为什么小室要染色，直接计数小室下表面的细胞不可以吗？最后计数是只计数染上色的细胞，还是小室下表面所有的细胞？多谢。
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