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蛋白质的测定——双缩脲法
关键词：标准物质 食品检测 农兽药残留 环境监测蛋白质的测定——双缩脲法
1．原理
当脲(尿素)被小心地加热至150～160℃时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲(也叫双缩脲)。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应。
由于蛋白质分子中含有肽键(一CO一NH一)，与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为560 nm。
双缩脲法灵敏度较低，但操作简单快速，是生物化学领域中测定蛋白质含量的常用方法之一，也可用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。
2．主要仪器
①分光光度计。
②离心机(4 000 r／min)。
3．试剂
①10mol·L-1氢氯化钾。
②碱性硫酸铜溶液：将lO mL10 mol·L-1氢氧化钾和20 mL 25％酒石酸钾钠溶液加到930 mL蒸馏水中，剧烈搅拌，同时慢慢加人40 mL4％硫酸铜溶液。
配制试剂加入硫酸铜溶液时，必须剧烈搅拌，否则将生成氢氧化铜沉淀。
③四氯化碳。
4．操作步骤
①标准曲线的绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含量40 mg、50 mg、60 mg、70 mg、80 mg、90 mg、100 mg、110 mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支50 mL纳氏比色管中，然后各加入1 mL四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液准确稀释至50 mL，振摇10 min，静置1 h，取上层清液离心5 min，取离心分离后的透明液于比色皿中。在560nm波长下以蒸馏水作参比液，调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A，以蛋白质的含量为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。
②样品的测定：准确称取样品适量(即使蛋白质含量在40～110 mg)于50 mL纳氏比色管中，加1 mL四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度A。根据测得的A值在标准曲线上可查得蛋白质质量(mg)，进而由此求得蛋白质含量。
5．计算
X= (c*100)/m
式中：X——样品蛋白质含量，mg·(100 g)-1
c——由标准曲线上查得的蛋白质质量，mg；
m——样品质量，g。
6．说明
①蛋白质的种类不同，对发色程度的影响不大。
②含脂肪高的样品应预先用乙醚脱脂后再测定。
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