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【求助】抗体杂质检测项中的HCP残留酶联免疫检测...
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我们用的Cygnus F550 CHO HCP ELISA kit，现在在做方法验证，专属性怎么做？希望有单抗药物临床申报经验的同行给点意见。
中检院曾指出过“对于不同的目的蛋白质，根据分子量大小和等电点的不同，会采取不同的分离纯化工艺。不同的分离纯化工艺会导致细胞蛋白残留量和组成上的较大差异。只有根据不同的生产工艺，制备工艺特异的细胞蛋白标准品和特异的抗血清，建立相应的检测方法，才能更真实反应供试品的’细胞蛋白残留量。”
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最新回复
shanzhapia696 (2016-4-11 22:28:08)
商业化的HCP kit检测的结果只能代表通用的那些HCP的含量和比例，但是每个项目都有其特异的HCP比例，且各个蛋白对HCP的检测干扰程度不一样，所以见了专属的HCP检测方法是非常必要的。我们公司申报的一个产品，就被CDE要求补充特异的HCP检测方法。
ukonptp (2016-4-11 22:28:30)
HCP抗体制备很少有免疫老鼠制备抗体的。cygnus试剂盒及abcam公司中的HCP抗体是羊多抗或兔多抗，这样的好处很明显，一次制备量可以够用几年甚至上十年，也避免不同制备批次间的差异。如后期工艺稳定，考虑工艺特异性，可另外再制备工艺特异性抗体，适合申报注册等。工艺特异抗原的制备，就是空白菌经过相同的发酵及纯化条件处理后所得，当然，纯化至哪一步，这个就得具体问题，具体分析了，不建议到最后一步，虽然针对性会更强，但不能保证不会缺失部分HCP，建议层析一步或两步，目的蛋白纯度达到一定要求就可以了。
HCP制备中免疫原性差异的问题是难以避免的，abcam公司针对大肠低分子量HCP的抗体，货号为ab181642，大家可以了解下。
对了，关于专属性验证问题，我们这里只考察了基质的影响。其实，houjinglhy 所说的也不错，可找其他相关蛋白验证，如你是CHO HCP试剂盒，是不是可以检测大肠或酵母的HCP，看是否存在交叉反应？
8s5g (2016-4-11 22:28:47)
专属性就是找一些市售的抗体药物或无关蛋白看看它的交叉反应吧。CNKI上有几篇做疫苗的宿主蛋白残留方法学的文章是这么做的，你可以参考下。但不知道这个对重组单抗适不适应。
一般宿主蛋白对照品都是通过裂解或冻融宿主细胞制备的。中检院的意思是你需要把通过裂解或冻融提取的宿主蛋白在你的整个工艺流程中走一遍，最后通过富集来获得“特异性的宿主蛋白”标准品。首先你的知道怎么富集宿主蛋白，其次你得要大量的宿主蛋白和工艺量才能获得足量的宿主蛋白。这个类似于化药里面自制杂质对照品一样。真要这么做代价也太大了吧。。。 还有你引用的这些话是从文件里看到的吗？何种渠道得知的
hulu呼噜 (2016-4-11 22:29:06)
这个地方的专属性指的是做你的缓冲液基质的影响，抗体特异性是试剂盒要证明针对细胞宿主蛋白的。
大桃子同学 (2016-4-11 22:29:31)
QUOTE:
中检院一篇旧的文献中看到的。上周在研讨会上听到Cygnus 3rd Generation CHO HCP kit在CHO-K、CHO-S、DG44三种细胞系中的检出率均只有60%左右，是通过2D WB和LCMSMS两种方法比较的。如果回收率60%左右，专属性验证是否就通不过了？ 如果Cygnus的试剂盒升级了，换用同种升级的试剂盒是否还要重新验证？8s5g (2016-4-11 22:30:01)
QUOTE:
你这个说的是属于检测灵敏度吧，专属性考察溶液或其他物质对方法的干扰toy (2016-4-11 22:30:24)
QUOTE:
一般好像都是用Cygnus的试剂盒检测HCP的，专属性问题可以用293细胞株的宿主蛋白作为对照说明对CHO细胞株的专属性。HCP蛋白制备，可以用稳定细胞株的空白宿主细胞株转染对应的空载体然后筛选到细胞株（不直接用宿主细胞株，这样可以更全面的说明HCP），进行补料培养取上清进行制备HCP（HCP的制备方法各显神通 ）。将制备好的HCP进行定量（蛋白定量方法很多种 ），用定量好的HCP来建立验证检验HCP的方法。
大桃子同学 (2016-4-11 22:30:59)
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大桃子同学 (2016-4-11 22:31:25)
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大桃子同学 (2016-4-11 22:31:42)
54528859.snap.jpg
831226 (2016-4-11 22:32:25)
专属性强的自然是自建ELISA方法，而不是商品化通用型ELISA试剂盒。
国外有些品种报产阶段，要利用自己的宿主（含空载体）免疫动物，获得的抗血清，分离纯化的多克隆抗体制备ELISA试剂盒。这些多克隆抗体自然是针对自己的宿主，但是这个方法也有局限性。1）开发周期半年以上，且成本过高。2）免疫动物获得多克隆抗体，只针对高免疫原性HCP。对于低免疫选型HCP，存在漏检的可能。
当然，除了ELISA外，也有2D-page，LC-MS等方法，但是这些还未在工业界广泛使用
不了解。国内报产阶段的HCP是否要求建立专属性方法。
ukonptp (2016-4-11 22:32:40)
millipore银染的300多种蛋白也比cygnus号称的能检出CHO HCP 700多种蛋白低很多。（不确定是不是用的cygnus盒子）这些可以发给cygnus技术支持问问。
其实不管检出率多少，参考6L所说方法，如果用自己制备CHO HCP定量作为标品，用商业化试剂盒检测，能得到相对浓度，是否可行了？
one (2016-4-11 22:33:38)
下面这张PPT是白玉老师在“生物类似药研发与评价”研讨班上分享的案例。
她就列举了采用商业HCP试剂盒做临床前研究导致临床试验失败的案例。
现在建立过程特异性的HCP检测方法越来越被认可，但是应该也不是强制要求。
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yyaxw84 (2016-4-11 22:34:11)
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准确度试验，回收率60%我觉得太低了吧 换了试剂盒肯定是要重新做验证的
tie8 (2016-4-11 22:34:27)
CDE老师讲解的是不是这个案例呀
yyaxw84 (2016-4-11 22:34:52)
QUOTE:
她没说 听你这么一说 应该就是这个吧7437654 (2016-4-11 22:35:17)
7437654 (2016-4-11 22:35:33)
QUOTE:
是的，就是这个案例xyw5 (2016-4-11 22:36:05)
商业化的HCP kit检测的结果只能代表通用的那些HCP的含量和比例，但是每个项目都有其特异的HCP比例，且各个蛋白对HCP的检测干扰程度不一样，所以见了专属的HCP检测方法是非常必要的。我们公司申报的一个产品，就被CDE要求补充特异的HCP检测方法。
BUK (2016-4-11 22:36:29)
QUOTE:
对呀，自己开发特异性ELISA成本太高。有什么解决办法么【求助】抗体杂质检测项中的HCP残留酶联免疫检测...