赛默飞世尔科技“蛋白质组学解决方案”网络视频讲座

2011-3-31 17:51 来源: 分析测试百科
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  3月30日下午,赛默飞世尔科技蛋白质组学市场专员唐佳向大家作了题为《蛋白质组学研究方法和Thermo蛋白质组学解决方案》的报告,主要介绍了以生物质谱为基础的各类蛋白质组学的研究方法和技术手段,包括蛋白质的高通量分离和鉴定、定量蛋白质组学、翻译后修饰蛋白质组学、Top Down 蛋白质组学等内容。

  蛋白质组学研究内容

  蛋白质组学的研究对象是生物体内所有的蛋白质,目标是发现它的组成和活动规律。蛋白质组学分为表达蛋白质组学和功能蛋白质组学两类。表达蛋白质组学采用高通量的蛋白质组学研究技术分析细胞、组织和生物体内尽可能多乃至于接近所有的蛋白质,对这些蛋白质进行分离、识别、定量、定位,从而构建某个细胞、组织或生物体全蛋白质的表达谱。功能蛋白质组学以某种特定细胞、组织或生物体为研究对象,研究蛋白质的翻译后修饰、蛋白质结构、蛋白质的定位及表达水平差异与功能之间的关系,研究蛋白质之间的相互作用及其意义,构建蛋白质功能网络。

  蛋白质的基本结构是氨基酸序列,通过鉴定氨基酸序列来匹配它的蛋白质,这是定性研究,是蛋白质组学研究的基础。现在蛋白质组学研究已达到的基本研究手段是:以生物质谱技术为核心,对蛋白质进行大规模、高通量分离、鉴定和分析。以生物质谱为基础的蛋白质组学分析方法主要有Bottom-up和Top-down两种方法,Top-down(自上而下)技术可以直接对完整的蛋白——包括翻译后修饰蛋白以及其它一些大片段蛋白测序,而非仅仅针对多肽;Bottom-up(自下而上)是传统的手段,它将蛋白质的大片段混合物消化/酶解成小片段的肽后再进行分析,是在蛋白质组学的研究中较为广泛使用的一种质谱技术。

LTQ Orbitrap Velos轨道阱质谱仪

  蛋白质的高通量分离和鉴定

  生物体内蛋白质种类繁多,性质复杂,数量庞大,动态范围广,因此,蛋白质样品在进入质谱前要进行预分离。常规的预分离技术有二维凝胶电泳、多维液相色谱、毛细管电泳等,另外还有一些针对特殊对象的分离方法,如:去除高丰度的蛋白、对低丰度蛋白的富集分离。唐博士说,一个成功的蛋白质组学实验必须兼顾样品制备、LC-MS/MS分离鉴定和数据处理的分析软件三方面,任何一方面不到位都可能导致实验的失败。Thermo可以为蛋白质组学研究提供全方位的解决方案,如蛋白质富集,细胞裂解、酶解,同位素标记等生物样品前处理;液相色谱、质谱,数据处理软件等一系列蛋白质组学鉴定、定量的解决方案。

  LTQ Orbitrap系列是Thermo最高端的组合质谱仪。LTQ Orbitrap组合质谱仪将LTQ 与专利的获奖技术Orbitrap整合,在LTQ 灵敏、快速的基础上增加了轨道阱技术的高分辨率、高质量准确度的特点,具备了从复杂体系中快速、灵敏、可靠地检测化合物的能力。LTQ 的所有分析性能及样品接口特点与Orbitrap宽广的动力学范围、卓越的灵敏度、高质量精确度和高分辨率等优点相得益彰。智能化、数据依赖的仪器控制确保了极大的分析灵活性,可方便根据不同分析问题灵活配置。在代谢物鉴定及“Bottom-up”蛋白质组学研究中,相应的数据采集及分析软件可将LTQ Orbitrap的强大分析性能转化成为精确、立即可用的数据信息。

  合适的样品前处理和分离方法,再加上高性能的质谱和数据处理软件,这样就可以进行高通量的蛋白质发现与鉴定、蛋白质的相对定量以及翻译后修饰蛋白质组学研究。Protein Discoverer 软件平台是一个综合性的、可拓展软件平台,可以对蛋白质组的数据进行定性和定量分析。取代了赛默飞世尔科技BioWorks™的Proteome Discoverer,是第一个商用的蛋白质组学数据分析平台,使研究者们可以在一个程序中,合并、比较和分析从多个来源来的数据。 Proteome Discoverer一个主要的优点是从多种裂解方法中分析信息的能力,从而去发现更多的翻译后修饰(PTMs),并提高多肽和蛋白鉴定的准确度。蛋白质鉴定用的Protein Discover & Identification 是建立一个搜索树,可以灵活选择搜索方式,为不同的搜索建立不同的方式,建好之后统一提交进行搜索。功能多样化,为用户提供多种选择。

LTQ Orbitrap电场轨道阱回旋共振组合质谱仪

  定量蛋白质组学

  定量蛋白质组学中比较传统的定量方法是二维凝胶电泳,它是根据蛋白质的分子量进行二维的分离,优点是直观可视(大的斑点即量多、小的斑点量少),缺点是对亲水性或疏水性极强的蛋白质有歧视效应,操作比较烦琐,动态范围也受到限制。凝胶蛋白质组学定量也有标记和非标记的方法,标记的方法灵敏度比普通凝胶技术高很多。

      近年来,基于质谱技术蛋白质组学定量方法飞速发展,这些方法包括同位素标记和非标记技术。蛋白质组学定量与小分子定量有不同的地方,这些不同的地方与蛋白质组学的特性是有关系的,蛋白质表达水平是动态的,而且蛋白质种类多、动态范围宽,作为载体的蛋白丰度很高,而与生理功能相关的蛋白(即研究者真正关心的蛋白质)丰度却又极低。蛋白质的大规模的绝对定量其实不一定非常有意义,大部分时间是选择性地对一些有意义的低丰度蛋白进行定量,基本的方法是先对低丰度的Biomarker进行相对定量,筛选后再进一步定量(比如绝对定量),这样才是高效有意义的生物学方法。

  基于质谱技术的相对定量技术,可以使用非标记的半定量技术或同位素标记的定量技术。同位素标记相对定量技术比较简单,目前常见的有体外标记(in vitro)试剂如ICAT、iTRAQ、和Thermo公司生产的TMT;以及体内标记(in vivo)试剂如SILAC两种。大部分体外标记试剂的原理都差不多,以TMT为例介绍体外标记的原理。一个TMT试剂有三个部分组成:质量报告子(Mass Reporter)、质量平衡子(Mass Normalizer)和蛋白质的反应端(Protein Reactive Group)。TMT现在可以同时标记6个平行试剂样品,可以根据需要进行标记。具体的做法是,n组(比如6组)平行的生物样本中,提取样品后,酶解成肽段,和不同的TMT标记试剂反应标记,再将标记后的样品送入质谱检测。一般来说,标记试剂和N端进行反应,不会影响肽段的结构,所以肽段仍然可以送入质谱根据MS/MS谱来定性鉴定;同时标记上不同TMT试剂的样品衍生的MS/MS报告子的分子量是不同的,根据这些报告子同位素峰的强度可推算出肽段的含量和蛋白质的表达量。比如我们可以定义一个量(比如相对量差异>1.5)就认为对比的两个样本有显著的表达差异,根据这个去寻找到我们关心的生物标志物。除了N端标记,也可以选择性地和肽段的半胱氨酸发生反应的TMT试剂,可以根据试验选择。

TMT试剂,红色*号标记的是同位素标记的原子,MS/MS中会给出不同分子量的报告子,通过不同的分子量对肽段进行相对定量。

        而SILAC是在培养介质中加入稳定同位素标记的必需氨基酸,如赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)等,主要用于高等动物细胞中蛋白质的鉴定与定量(in vivo)。

       Thermo提供的软件可对各种体内或体外标记的样品进行分析。

  在研究生物标记物的时候,必须先要找到那些在量上有明显变化的蛋白质,然后再去进行深入的有针对性的研究,包括绝对定量的研究。

        除了同位素标记的方法之外,我们还进行一些非标记(Label-Free)的定量技术,它是以大量的生物质谱数据为基础,以一定的标准来对生物样品进行生物标志物的筛选。非标记定量技术要求仪器(如LC/MS/MS)有非常好的稳定性,这样才能得到重现性好、可对比的质谱数据;同时也要求有专业的软件来进行筛选工作。

  SIEVE是Thermo提供的一款非标记定量分析软件,SIEVE的词义即“筛选”。它可用于批量质谱数据处理,提供出由它筛选出的有特征的蛋白质以及趋势变化的信息,这些结果都是具有统计学意义的。它不仅可用于肽段和蛋白质,也可用于小分子,如代谢组学等(研究代谢组学时换一个数据库)。

       在得到了一个生物标志物之后,我们就可以对选定的目标蛋白质进行绝对定量,为医疗诊断提供一个目标蛋白质定量分析的方法。医疗诊断中现在大多以抗体方法为基础来定量,但抗体难以获得、研究方法速度慢、抗体也很昂贵。在生物质谱中以三重四极杆技术为基础的定量方法一直都被广泛应用于小分子定量上,现在也可以应用于高通量的大分子肽段定量上,来高通量、低成本地进行分析。Thermo专门设计研究的三重四极杆质谱TSQ系列和PinPoint软件,都可以在复杂的蛋白质混合物中定量痕量的目标蛋白质,并且获得了重复性成果。这里检测技术的一个关键是SRM对于肽段如何选择合适的离子对。这里可以根据以前实验中得到的MS/MS谱图选择离子对,也可以根据蛋白质序列使用SRM分析软件在计算机模拟(in silico)的基础上选择离子对,这种选择离子对的过程可使用PinPoint软件来帮助选择,优化选择最好的离子对。另外,如果仅仅选择1、2个离子对,有可能是错的;这里可以用iSRM技术(intelligent SRM),即检测到一个主要的SRM离子对后,可以自动触发选择一些次要的SRM离子对,这样可以大大提高检测的准确性。对于目标蛋白质定量,国外已经有一些不错的应用。唐博士也介绍了一些国外的网络讲座。

Thermo蛋白质组学解决方案

  翻译后蛋白质修饰组学

  磷酸化蛋白质组学是在蛋白质的一些氨基酸的基团上发生了磷酸化的修饰。在生物体中最常见的磷酸化类型是丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸酯化;在现今的技术条件下,采用一些特殊的分离富集技术并结合生物质谱技术,已经可以实现大规模、高通量的蛋白质磷酸化氨基酸残基的定位和磷酸化蛋白的鉴定。根据磷酸根丢失产生的中性丢失特殊峰,进行串联质谱扫描,分析磷酸化肽段。

  糖基化蛋白质组学相对磷酸化蛋白质组学稍微复杂一点,主要是由于糖链结构比较复杂。现在通过减去糖链的方法,如O-糖和N-糖的糖链去掉之后,进行大规模、高通量的糖基化位点的鉴定。由于糖链结构比较复杂,大规模糖链的解析和匹配还面临很大的挑战,比如说N-糖基化位点的鉴定,可以用糖苷酶除掉N-糖的糖链,根据增加1道尔顿的特征(去糖链时原天冬酰胺会被还原成天冬氨酸,分子量增加1 Da)去判断糖基化的位点。糖链结构的解析采用串联质谱的方法,比较复杂,常常需要三级以上的多级质谱来鉴定糖链的结构。

  Top Down 蛋白质组学

  Bottom-up仅能得到不完整的肽段序列,因此又开展了Top-down蛋白质组学研究。Top-down可识别与定位PTMs、RNA的可变剪接,氨基酸衍生物等等,而且可以识别和定量蛋白质的异构体isoform,进而研究通常由PTMs调控的信号和调控网络,这些因素共同决定了蛋白质的活性状态、定位、转移和相互作用。Top-down蛋白质组学研究的关键点也在质谱和软件,蛋白质分子量非常大,如何选择合适的质谱条件是Top-down技术的第一步。在软件方面,Thermo提供了ProSightPC这个软件来支持Top-down的研究,ProSightPC可以在一个给定蛋白或肽段上鉴定一个未知质量的修饰,这个修饰可能是由于小段肽段的丢失,同源取代物,翻译后修饰,或由于样品前处理造成的人工缺陷,而且不需要预先知道是什么修饰。ProSightPC还可以很好地提高检测的通量。目前而止,对5万Da以内的蛋白质进行高通量的Top-Down已经较成熟。

   

   赛默飞世尔科技蛋白质与核酸分析应用技术专辑,可以索取


  Q&A

  网友:实验过程中某一种蛋白质通过色谱和质谱的丰度会有多大的损失率,损失率和蛋白质的哪一种性质有关?是否能估算这种损失率?

  唐佳博士:这个问题确实存在,若处理好的话,蛋白质的回收率可以达到90%以上,这跟仪器的条件、柱子的条件以及操作的熟练程度都是有关系的。所以,无法给出一个通用的损失率,但是损失率可以被控制。

  网友:iSRM会不会使检测的速度变慢?

  唐佳博士:第一步是iSRM检测,第二步是数据触发,第三步实际还是检测,虽然定义了很多,但速度还是很快的,不会影响鉴定的速度。

  网友:关于TOP down研究,你们分子量能做到多大,比如50K的蛋白质,序列覆盖率能有多高,你觉得这个技术现在能做到多大分子量,难点在哪?

  唐佳博士:50K(5万)分子量的蛋白质不是个问题,像讲座中举出的一个例子,就是分析15万分子量的抗体。肽段的覆盖率不仅跟质谱有关,也跟样品处理有关,还要尽量把仪器所有的碎裂方式(如CID、HCD、ETD等等)都结合起来,这对肽段覆盖率是很有帮助的。建议采用Bottom-up的方式去提高肽段覆盖率,并用多种蛋白酶混合作用,数据综合起来进行肽段的研究。

  网友:pinpoint软件生成的MRM的方法,我从你的讲座中得到,你是高通量做MRM或iSRM方法,成功率大概是多少?比如60min的梯度,做1500个MRM,成功率多少?

  唐佳博士:在肽段中进行离子对的检测,是跟选择的离子对关系很大。如果选择的离子对特别适用,而且是实际优化,那么成功率就很大;否则,成功率就受到影响。当然,这跟实验条件是有很大关系的。

  网友:TMT标记和SILAC标记方法的区别?

  唐佳博士:主要区别是:TMT是体外标记,而SILAC是体内标记。

      TMT标记是衍生化试剂跟肽段的氨基酸发生反应,是把样品处理后,在溶液中使肽段跟衍生试剂反应,既然是衍生化反应,就需要去优化反应,以提高衍生效率,不过TMT可一次标记6个平行样本,对于样品也没有什么限制(比如动物或人中来源的样品也可以);

      SILAC是体内标记,它不存在衍生效率的问题,它在培养基中进行标记,培养基中就含有同位素,一个是氢的同位素去标记,另一个是重氢标记的氨基酸,不过SILAC目前只能标记两个平行样本,并且必须针对那些可以进行培养的样本(不可能让生物去吃一些培养基)。

  网友:提取蛋白过程中如何避蛋白污染的问题,请给予些建议。

  唐佳博士:提取蛋白质常遇到人体角蛋白等的污染,一些常见的手段如:做实验时要把所有的头发扎起来,戴上帽子和口罩。另外,要选用质量比较好的手套和乳胶管、塑料管等。


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