【求助】引物稀释

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• cj_mondy (2015-6-03 18:15:04)

  
  记得管上会写是几个OD吧,还有就是几个nmol,我要是没记错,应该是这样的,如果管子上写3.9nmol,那么你就可以加39μl的水,就变成了100μmol/l的储存液了，然后使用的时候再稀释２０倍就变成５μmol/l，就可以使用了啊

• zzzz (2015-6-03 18:15:20)

  
  举例如下：根据你合成报告单上的说明（生工）附注中所示每OD的引物加XXul的缓冲液配成100uM的储存液。假如我的合成报告单上附注，每OD的引物加55ul的缓冲液配成100uM的储存液,而我的PCR体系要求引物浓度是2.5uM，那我先稀释4倍，就是加220ul的水到干粉（稀释前要离心，使干粉到管底），然后再每次用时，再拿其中的一部分，分装稀释10倍就可以了
  注意引物最好不要多次冻溶，这样易降解。如果试验中发现引物效率降低，既以前p的很亮，现在不亮了，要重新配置引物，减少实验耽误时间。如果发现引物二聚体明显，可以考虑在高温条件下把引物煮一下！

• woshi (2015-6-03 18:15:36)

  
  请问缓冲液用超纯水还是用DEPC水?多谢了!

• newway (2015-6-03 18:15:57)

  QUOTE:

  原帖由 woshi 于 2015-6-3 18:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  请问缓冲液用超纯水还是用DEPC水?多谢了!

  您所说的缓冲液是指什么？是指溶解引物的吧？一般都是用超纯水或者TEbuffer来溶解，不要用DEPC水，DEPC水呈弱酸性，oligoDNA容易在酸性溶液中降解，不利于保存，我们都是用灭菌的双蒸水溶解，溶解前干粉离心，让干粉沉在管底，加溶液后振荡混匀，保存一年都还可以使用，使用前充分溶解，关键是双蒸水不要偏酸和不要反复冻融，最好将大管分装成几管使用。

• JK.jon (2015-6-03 18:16:12)

  
  多谢了,对,我说的缓冲液就是溶解引物的,我用的是超纯水,后来想想DEPC不错,因为DEPC是消除RNA酶的,如果做RT的话,引物里边如果含有RNA酶就不行了,超纯水是否经过RNA酶处理也不能保证,所以我认为DEPC更好!请多多指教!个人意见!呵呵!

• NBA (2015-6-03 18:16:28)

  不能用DEPC水，因为PCR反应是在弱碱性条件下进行的。
  我建议先用PH=8.0的TE溶解成100uM的母液，用时在根据需要稀释成5-10UM。

• 小鱼鱼 (2015-6-03 18:16:47)

  
  我也来说两句。以下的问答转自上海生工的技术支持内容：
  —————————————————————————————————————————
  2.怎样溶解引物？
  我们的的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L（即100pmol/ul）浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水（PH>6.0）或TE缓冲液（PH 7.5-8.0），开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟 的转速下离心1分钟，防止开盖时引物散失。
  —————————————————————————————————————————
  其中所说的“无核酸酶的双蒸水（PH>6.0）”我个人的意见是：它就是DEPC处理水（经高压后就无RNase酶）。但PH值是否>6.0我还没来的及检测。不知大家对于这个问题有何看法？

• remenb (2015-6-03 18:17:03)

  
  融解引物的话使用超纯水就足够了（按照我们实验室的习惯，将超纯水装瓶子里灭菌后使用），不需要用DEPC水。因为DNase的稳定性远不如RNase，只要高温处理就可以灭活。
  当然如果引物是反转录中cDNA第一链合成时使用，或者一步法RT-PCR就需要使用DEPC水。不过如果cDNA第一链已经合成了，用这个cDNA作为引物跑PCR的引物不需要用DEPC水，因为此时已经不需要担心RNA降解了。
  对于一般引物融解方法，个人比较同意楼上 岸上的鱼 战友的说法。DNA在酸性条件不稳定，引物降解对PCR效率影响很大的。

• remenb (2015-6-03 18:17:23)

  用这个cDNA作为引物跑PCR的引物不需要用DEPC水，因为此时已经不需要担心RNA降解了。
  
  =======================================
  
  上面写错了，应该是用这个cDNA作为模板...

• jude (2015-6-03 18:17:45)

  QUOTE:

  原帖由 cj_mondy 于 2015-6-3 18:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  记得管上会写是几个OD吧,还有就是几个nmol,我要是没记错,应该是这样的,如果管子上写3.9nmol,那么你就可以加39μl的水,就变成了100μmol/l的储存液了，然后使用的时候再稀释２０倍就变成５μmol/l，就可以使用了啊 ...

  你的结果不准确，应该是100μmol/ml.
  呵呵
  常规的PCR一般引物使用量在2pm-10pm之间。所以我们一般把引物配成100pm/ml的stocks分装，然后在配体系时进行稀释。

• cj_mondy (2015-6-03 18:18:08)

  QUOTE:

  原帖由 jude 于 2015-6-3 18:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你的结果不准确，应该是100μmol/ml.
  呵呵
  常规的PCR一般引物使用量在2pm-10pm之间。所以我们一般把引物配成100pm/ml的stocks分装，然后在配体系时进行稀释。 ...

  是你错了

• xue258 (2015-6-03 18:18:25)

  
  1μmol=1000 000pmol,所以 100pmol/μl=100μmol/L,
  Modify 战友说的是对的

• fox_79 (2015-6-03 18:18:43)

  
  经高压后的水可不是无RNase酶的水，除非是经DEPC处理过的水高压后才是无RNase酶的！单纯的灭菌高压是不能将RNase酶灭活的。

• NBA (2015-6-03 18:18:59)

  那用什么溶比较好呢？ 自己配的TE 行吗

• whitesheep (2015-6-03 18:19:18)

  
  昏，我们一般都是用TE溶的

• gogo (2015-6-03 18:19:40)

  各位高手求助一篇关于电生理方面的文献题目是 Methods to identify the pulmonary vein ostium 发表于Heart Rhythm 2005 2:10 (1090-1093)