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【求助】同样条件PCR又扩不出来了，为什么？
【求助】同样条件PCR又扩不出来了，为什么？
我根据基因间重复序列设计引物，对大肠杆菌基因组进行扩增，前几天都扩出来，可这几天用同样的条件，相同的体系括了好几次都没扩出来，不知道什么原因，哪位高人能帮忙分析一下可能是什么原因。pcr体系：50微升体系，Taq 0.5微升；10*PCR Buffer 5微升；dNTP 4微升，引物 20pm; 模板 2.5微升，无菌水37微升。条件：94℃,10min; 94℃, 1min; 42℃,1min; 72℃,8min; 72℃,15min,2-5步循环35 次
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ujne (2015-8-05 10:29:00)
am10 (2015-8-05 10:31:43)
yes4 (2015-8-05 10:32:01)
我也是啊，明明同样的条件，就是p不出来了。引物，酶，buffer，dntp全换了新的。。温度也做过梯度，浓度也做过。。怎么都出不来。。电泳maker很清楚，也不是电泳的问题。。。。。晕死了
whitesheep (2015-8-05 10:34:41)
换比较好的酶试试。做阳性对照。如果还不行，重新设计引物了。
tudou85 (2015-8-05 10:36:45)
一般能P出来。偶尔出不来，以下几点分析：
1、基因组变性95度，试试
2、枪不准。特别是酶，由于不准，加的少了，就加2次
3、PCR管与仪器接触不紧密，散热不好
4、50体系比100体系散热好
5、使用降落PCR在很大的合适温度范围内
6、平行做几管，即使一管没出来，另一管也能出来
youyou99 (2015-8-05 10:38:12)
我也是啊,郁闷死了,不知道你们现在都解决了没有.
gmt (2015-8-05 10:39:08)
newway (2015-8-05 10:39:38)
我这也是，同样的条件就是做不出来呵呵
txwuyan (2015-8-05 10:40:41)
gmt (2015-8-05 10:43:28)
我在做的时候遇到过这种问题,不知道大家有没有考虑过加样顺序的问题,我专门做过实验,在我的实验室里,以下的加样顺序是结果最好的(这里的最好是指成功率最高及扩增条带做agarose electophoresis后条带的亮度最亮),我是20微升体系,按照以下顺序依次加入:10*buffer2微升,MgCl21.5微升,primers2*2微升,dNTPs0.8微升,Taq DNA polymerase2微升,template2微升,ddH2O7.7微升
ero11 (2015-8-05 10:43:58)
我也遇到过类似的情况,请教了一老师,给我分析了好多可能的原因,最后查得原因是底物浓度过高,后来把底物浓度稀释了近百倍,果然做出来了.老师说可能是因为底物浓度过高导致扩增的单链不能连接起来,老师还说了,下一次我们写教科书时PCR扩不出来的原因就多了一条------底物浓度过高
下面是一些经典的原因:
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本 前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引 物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓 度。④增加模板量，减少循环次数。
junhun (2015-8-05 10:45:32)
呵呵，原来是买的新酶的buffer有问题，换旧酶的buffer做出来了，真亏了。
dog002 (2015-8-05 10:45:50)
后来换了体系和程序就P出来了
remenb (2015-8-05 10:47:03)
我有一次就因为这个实验耽误了1个月，欲哭无泪啊
yizhi (2015-8-05 10:47:18)
kulee (2015-8-05 10:47:53)
PCR反应本身很灵敏，而扩增结果受到多个因素的影响，有时扩不出来是很正常的事情，我也碰到过这样郁闷的事情，后来一解决就没有问题了，我一般从以下几个方面去分析失败原因：
1.做阳性对照与阴性对照，这一点我觉得很有用，尤其在扩增出现问题的时候，用个质粒什么的做阳性对照，如果能扩出来说明扩增体系和酶没什么问题，用水做阴性对照可知道有没有杂的模板混进来
2.如果上述检查没问题，调整或更换模板再试试
3.如果扩增结果有但不满意，调整退火温度，做个梯度或者TD-PCR看看有没有差异
4.更换引物
个人经验之谈仅供大家参考，希望能有所帮助
xevin (2015-8-05 10:49:17)
PCR一些常见的问题大家一般都会注意，我觉得以下两个条件也应该注意：1、反应体系的大小。如果p不出来的时候，可以适当减少反应体系，比如把50微升减到20微升。体系小一些有利于反应的进行。我曾经就这样成功过。
2、每次做PCR，PCR仪是否是同一台。我们实验室有个阶段出现一个很奇怪的现象，就是两台PCR仪，有的在其中一台能P出来，另一台P不出来，有的则相反。
ns5fan (2015-8-05 10:49:48)
还可以考虑换换水试试，最不可能出问题的地方也可能正是问题所在。我曾经因为水的问题几周都不出结果，最终知道是水的问题的时候快吐血了！
nn255 (2015-8-05 10:50:05)
我也到相同的情况，正在煎熬中！！！！哈哈阿！！！！
还没有找到原因呢。
前几天还能够扩出来的，可是准备上回收胶时候就扩不出来了，郁闷亚！！！！
已经将所有需要的成分都换成新的了，可是还是没有结果；阳性对照也没有扩出带来。
我分析可能是刚刚买来的酶有问题，明天用旧的酶是一是！！
希望各位战友帮忙分析一下，还有那些可能的原因！
DCS (2015-8-05 10:51:11)
不知道用什么模板
如果是cDNA的话尽量不要反复冻融
有的时候两三次就玩完
【求助】同样条件PCR又扩不出来了，为什么？