【求助】细胞不同部位蛋白的提取方法

最新回复

• JK.jon (2015-8-10 17:47:38)

  有通用的蛋白抽提试剂盒：分胞浆蛋白和核蛋白两种

• youyou99 (2015-8-10 17:47:53)

  
  以下是我们实验室用到的方法，屡试不爽，相关成果发表在Molecular Cell上。
  Chromatin Fractionation
  1．about 3 × 106 cells were washed with PBS and resuspended in 200 ul of buffer A (10 mM HEPES (pH 7.9), 10mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.34 M sucrose, 10% glycerol, 1 mM dithiothreitol,0.1% Triton X-100 and protease inhibitor mixture (Roche Molecular Biochemicals).
  2. the cells were incubated for 5 min on ice.
  3.Nuclei were collected in the pellet (P1)by low speed centrifugation (1500 × g, 4 min, 4 °C).
  4.The supernatant(S1) was further clarified by high speed centrifugation (13,000 ×g, 10min, 4 °C) to remove cell debris and insoluble aggregates. The supernatant was designated S2.
  5.Nuclei were washed once with buffer A without 0.1% Triton X-100 and then lysed in 200 ul of buffer B (3 mM EDTA, 0.2 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol, and protease inhibitor mixture).
  6.After a 10min incubation on ice, soluble nuclear proteins (S3) were separated from chromatin by centrifugation (2000 ×g, 4 min).
  7.Isolated chromatin (P3) was washed once with buffer B and spun down at high speed (13,000 ×g,1 min).
  8.remove soup and restore the pellet(P3) in 200ul sample buffer.

• ending (2015-8-10 17:48:09)

  那请问楼上的S2就是胞浆蛋白吗？

• yyaxw84 (2015-8-10 17:49:00)

  QUOTE:

  原帖由 ending 于 2015-8-10 17:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  那请问楼上的S2就是胞浆蛋白吗？

  胞浆可溶性蛋白。

• vvmmoy (2015-8-10 17:49:15)

  
  我曾看过一篇文献，用western blot方法分别检测了线粒体内cyto c和线粒体体外的cyto c的量，请问这个是用什么方法分别获得线粒体内、外总蛋白的呢？

• windy+++ (2015-8-10 17:50:23)

  
  一般来说,提细胞蛋白可以分成以下几种:总蛋白,核蛋白,胞浆内活性酶及膜蛋白等.总蛋白,一般加上样缓冲液煮煮就完事了,如果不能变性,那就用RIPA;核蛋白,市场上有专门的提取KIT,自己配试剂有点麻烦;胞浆内的活性酶,需要用不含变性剂的非常温和的缓冲液,市场上也有相应的KIT,要注意的就是让你的目的蛋白不变性,少变性;膜蛋白提取是最麻烦的,含量少,不容易被溶解,一般用NP-40,RIPA等或者一些成品KIT,但有些膜蛋白非常顽固,需要试一些去垢剂,但如果,不需要在意膜蛋白的结构,那么就使劲让它溶解变性吧,但别弄沉淀了.

• chengjie79 (2015-8-10 17:51:41)

  
  其实并不是根据细胞部位分的，而是根据蛋白性质，比如常用的percoll，
  根据部位的话很难，最多也就是先吧细胞核分出来

• chengjie79 (2015-8-10 17:52:27)

  QUOTE:

  原帖由 youyou99 于 2015-8-10 17:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  以下是我们实验室用到的方法，屡试不爽，相关成果发表在Molecular Cell上。
  Chromatin Fractionation
  1．about 3 × 106 cells were washed with PBS and resuspended in 200 ul of buffer A (10 mM HEPES (pH 7.9), 10mM ...

  
  请问与chromain紧密结合的蛋白，你们怎么提取？
  貌似你说的这篇文章我看过，但是我不太明白与chromain紧密结合的蛋白，你们怎么提取的？

• youyou99 (2015-8-10 17:52:42)

  
  用SampleBuffer直接溶解染色体结合蛋白 as indicated above with "P3"

• chengjie79 (2015-8-10 17:52:58)

  问一下，第五步中是用什么破核膜的？

• chengjie79 (2015-8-10 17:53:14)

  
  5.Nuclei were washed once with buffer A without 0.1% Triton X-100 and then lysed in 200 ul of buffer B (3 mM EDTA, 0.2 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol, and protease inhibitor mixture). 在你们的步骤中，其中第五个步骤说是用BufferB lysed。不知道bufferB 中什么组分可以破核膜啊？还望指点一下啊！谢谢啦！
  bigbang_0_0 wrote:
  以下是我们实验室用到的方法，屡试不爽，相关成果发表在Molecular Cell上。
  Chromatin Fractionation
  1．about 3 × 106 cells were washed with PBS and resuspended in 200 ul of buffer A

• veiwu (2015-8-10 17:53:35)

  
  我要提取膜蛋白，用的是Pierce的试剂盒，可是最后一步说会有亲水层和疏水层的分层可是我做了两次就是没看到。。。郁闷死了，你们各位有谁提过膜蛋白的分享下经验吧

• 吉吉0120 (2015-8-10 17:53:56)

  
  做膜蛋白，你得用ANATRACE或者AVANTI的DETERGENTs.用那些盒子只能提部分的膜蛋白。不同的膜蛋白要用不同的DETERGENT，要不然就一个结果，沉淀。

• dodoit (2015-8-10 17:56:06)

  
  我养的是肌肉细胞，只要测量细胞内的总蛋白含量。我看文献后的提取方法是：
  After centrifugation, protein pellet was dissolved in 1 ml NaOH 1 N and incubated at 37‡C for 12 h. Soluble protein contents of the solutions were determined by spectrophotometric method using a biuret-like reaction (Protein Assay ESL, Boehringer Mannheim kit).
  我想了解一下，这样提的蛋白是不是已经变性了？这对测定蛋白含量有没有影响？
  反正我看western blot方法提取总蛋白的方法不是这样的，它和我上面的方法之间的差别是不是就是防止蛋白变性？

• vcve (2015-8-10 17:56:22)

  用BIOVISION的试剂盒，这个进口的，效果比较好~~我用的就是~

• mod=8048 (2015-8-10 17:56:38)

  
  膜蛋白提取盒子哪个牌子好啊？

• yizhi (2015-8-10 17:57:13)

  
  膜蛋白提取盒子哪个牌子好啊？

• yizhi (2015-8-10 17:57:33)

  请问一下细胞不同部位蛋白的提取方法，最近看了一些文献，比如细胞的总蛋白，膜表面蛋白，胞浆蛋白，胞核蛋白，似乎都有不同的提取方法，不知道有没有高手可以告知具体的步骤和大致的原理，非常感谢了。
  
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  具体步骤，查文献可以收到很多不同版本，这里就不贴了：）我做过chromatin，mitochondria，membrane，nuclei，cytoplasm，以及一些特殊的膜成分，比如lipid rafts等的分离，我说点我自己理解的基本原理吧。
  分离各种成分，主要有粗分离和细分离两种区别。粗分离，一般不涉及蔗糖介质以及密度梯度离心，用于大部分常规实验，文章里准确描述应该是XXXX fraction。细分离，得到的比较纯的细胞器或者某个部分，一般使用密度梯度离心，多使用蔗糖做介质，文章里可以说具体的XXXX，不加fraction这个词，比如isolation of mitochondria。
  粗分离，针对不同的成分的分离方法，主要差别在于去垢剂的选择和去垢剂的作用时间的选择，也有用低渗结合匀浆破细胞分离组分的，但作为粗分离而言，去垢剂可以满足大部分要求，后面会简单提一下低渗匀浆的方法。了举数例，
  1，比如分离核组分，常用NP40，因为其对核膜的破坏作用更小；
  2，分离mitochondria组分，可以使用digitonin，因为线粒体外膜非常脆弱，极容易在分离时破裂，导致内外膜间许多成分释放出来；
  3，分离细胞膜成分，要看实验目的，大部分膜蛋白，0.05%的triton X-100处理半小时，就可以溶解下来，因此很多时候不使用去垢剂，而使用渗透压法匀浆，然后离心分离收集。当然膜蛋白溶解，不代表膜结构破坏，因此粗分离细胞器组分时仍然可以用去垢剂处理，只要时间和浓度得当，细胞器内蛋白不会释放出来，某些细胞器结构特殊，内外两层膜，比如线粒体，自然之间的成分这样操作会释放出来；
  4，分离细胞质组分，渗透压匀浆加适当转速离心即可，偷懒的话也可使用去垢剂，因为虽然许多膜蛋白会溶解在细胞质组分里，但并不影响一部分实验的目的。
  5，染色体分离，相对简单很多，因为其结构比较致密，且在细胞核内，无太多特殊要求。
  这里谈到的不同的去垢剂对不同细胞器的作用差别，都是需要考虑作用时间因素和浓度的，不能绝对单一化其偏好性。
  粗分离常用到匀浆器，dounce glass homogenizer，不是打豆浆用的匀浆机：）。好的匀浆器是决定组分成功分离的关键所在，尤其是精细分离的第一步因为多不使用去垢剂，而靠匀浆低渗透破碎细胞，因此这一步更是决定细胞各组分完整性的关键，匀浆次数，匀浆速度，匀浆器的容积选择，匀浆器的内表面结构都是重要影响因素。比如，分离绝对纯化的线粒体，一个技巧就是用砂纸打磨匀浆器，这个有相当技巧，对一些要求极高分离实验很有效，不过一般实验用不上。如果谁能分离完整的线粒体，他就可以分离任何细胞器：）
  粗分离，可以满足很多实验要求，但存在的几个问题，做实验的人必须清楚，才能在写文章，分析数据，下结论时措辞正确：
  1，任何一个细胞器甚至细胞核不用密度梯度离心是无法和其它细胞器或者结构蛋白严格区分的，所以我们称之为组分。
  2，细胞核虽然可以很容易和其它细胞器区分开来，但细胞骨架在粗分离实验中总是和细胞核一起离心下来，而细胞骨架有许多蛋白结合在其上，某些时候会影响结论。
  3，actin不是细胞质marker，细胞核内有actin，还可以参与转录调控（常有人犯这个错误）
  4，膜蛋白很容易被去垢剂溶解下来，所以涉及膜蛋白的分析，要特别小心，尽量不用用强去垢剂，或者不用去垢剂。
  先写到这，以后有空再接着谈细分离

• shenkunjie (2015-8-10 17:58:04)

  我养的是肌肉细胞，只要测量细胞内的总蛋白含量。我看文献后的提取方法是：
  After centrifugation, protein pellet was dissolved in 1 ml NaOH 1 N and incubated at 37‡C for 12 h. Soluble protein contents of the solutions were determined by spectrophotometric method using a biuret-like reaction (Protein Assay ESL, Boehringer Mannheim kit).
  我想了解一下，这样提的蛋白是不是已经变性了？这对测定蛋白含量有没有影响？
  反正我看western blot方法提取总蛋白的方法不是这样的，它和我上面的方法之间的差别是不是就是防止蛋白变性？
  ......
  
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  测定蛋白含量，蛋白变性没有关系，很多测定方法本身就引入变性过程。WB提总蛋白的方法很多，其中最简单的一种就是SDS缓冲液处理直接变性。

• zhy平平 (2015-8-10 17:58:29)

  
  核质分离是最常见的，在网上也不容易找到方法。