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【求助】空肠、回肠、胰腺的β-actin表不表达？
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大家好，我最近做某目的蛋白，是关于能量代谢的一个蛋白，由于做的组织较多，其中包括空肠、回肠以及胰腺。目的蛋白的条带都出了，可用β-actin做内参跑western条带时，因为我是一组5个样品，只出了其中三个，做了三次，还以为是一抗孵育、转膜等等其他问题，可是我避免了这些问题后仍然再做发现，我无论如何做，仍然是条带缺失，仍是有一部分没有条带，按理说，抗体应该是敏感性很强的，我组内用的是进口的抗体，没有质量问题。后来我考虑可能因为蛋白降解所以不出条带，我平常都用-20℃的分装的冻存样本，后来我把-80℃的拿出来 又做了次，发现仍然是条带 缺失，空肠，回肠。胰腺的β-actin均是如此，用考马斯染过后，证明确实有蛋白存在膜上，但不知道为什么β-actin总是不出，极其郁闷，想请过来人帮忙解答，谢谢！
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最新回复
plaa (2013-6-29 10:19:41)
一抗、二抗的稀释度多少？
dragonkilly (2013-6-29 10:20:06)
因为你不该用bata-actin作为检测肠组织的内参，因为肠组织属于平滑肌，其actin不是bata型的。你或者换抗体或者换内参，应该就可以解决你的问题。
shanzhapia696 (2013-6-29 10:20:35)
QUOTE:
一抗 1:2000 二抗 1:2000shanzhapia696 (2013-6-29 10:20:53)
QUOTE:
您好，我弱弱的问一下，我没怎么细看b-actin的说明书，上面貌似只说在心肌、骨骼肌不能用，因b-actin是胞浆蛋白吗，几乎其他组织都表达，而且我还有一点想不明白的是，我的条带是部分缺失，一组5个样，前三个有带，后俩没有，如果b-actin不能用作肠子内参，那为何我还出了一部分呢？是不是我切组织的时候，切到部分不是平滑肌的，所以就表达了部分呢？我查阅了一些文献，发现文献里肠子大都是做免疫组化。免疫荧光等等技术比较多，目前在我实验室，我打听到的还没有人做肠子的western,这个课题是老板订的，我需要拿出充分的依据来说服我老板，所以想请问楼楼是以前做过，还是有什么参考文献抑或是其他可靠的依据可以证明这一点，我目前也在找这方面的依据，我做这个快郁闷了，老板只会挑我实验毛病，一味的叫我做，唉，所以还请楼楼指导，谢谢！lagua123 (2013-6-29 10:22:37)
cuturl('http://biogps.org/#goto=genereport&id=60')
这里查到的表达量看胰腺和胰岛几乎没有ACTB表达，骨骼肌也没有但是心肌和平滑肌里表达量应该很高。小肠里表达量较低，如果你的样品里面恰好有很多结缔组织的话做不出来也是有可能的。换一个内参吧
dragonkilly (2013-6-29 10:23:07)
在这个帖子中cuturl('http://protein.dxy.cn/bbs/topic/9669973') 我的大号xray19，及iris_palm战友有过详细的讨论， 你可以看一下。b-actin 作为平滑肌内参可能存在问题，这跟公司抗体制备方法和actin的分型有关（不知道你前三个有条带是什么样子的，淡淡的还是浓粗的？）。如果可能还是尽快换为gapdh内参。仅供参考吧。
shanzhapia696 (2013-6-29 10:24:47)
糖尿病
我还想问GAPDH是否与糖代谢有关啊？因为我做的目的蛋白和大鼠造模均与糖尿病胰岛素抵抗以及能量代谢有关，会不会干扰？
dragonkilly (2013-6-29 10:25:06)
相关疾病：
糖尿病
GAPDH参与糖酵解，但糖尿病胰岛抵抗模型是否影响GAPDH表达，这个我也说不准，但私下个人以为是没有太大影响的。但你最好先查看下文献，以便应对将来投文章审稿人的质疑。如果，gapdh不行的话，考虑tublin？
shanzhapia696 (2013-6-29 10:25:38)
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你好，我做的目的蛋白是丙酮酸脱氢酶复合体PDH，是丙酮酸氧化脱羧反应的关键酶，也是胰岛素信号通路下的一个分子，目前我只查阅到这个分子在心肌和骨骼肌的论述，带有条带的文章还没查到，其他组织的更是没有，我不求发文章啊，这只是我的硕士毕业课题，学校15号放假，我年前做不完啦，唉，就这b-actin不出，目的蛋白已出。目前组内还没有其他内参可用，我们组就有一瓶b-actin哭死我了 老板坑死我了 谢谢楼楼指导啊 我决定明天和老板去谈判
shanzhapia696 (2013-6-29 10:26:32)
弱弱的补一下，就这个分子，我做骨骼肌的时候，b-actin也不出，后来看了说明书才知道，而且做骨骼肌的时候，其蛋白提取方法不同，貌似得匀浆，我组内实验室的那个匀浆机跟大钻子似的，1.5ml的Ep管放进去，不用说匀浆，直接就没了，大鼠的骨骼肌，能有屁大点当时就这个原因和我老板谈判，瞬间被骂没词儿了，“当时取大鼠各个组织器官的时候，取完就放液氮里了，谁还给你专门就骨骼肌拿出来粉碎啊，匀浆啊，我伺候你啊？谁伺候你啊？哪那么多毛病！'这老板原话，我被瞬间击溃！
lagua123 (2013-6-29 10:27:09)
lagua123 (2013-6-29 10:29:02)
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骨骼肌里长长的都是a-actin, b-actin能做出才奇怪了...
样本少的话手动匀浆不行么...
shanzhapia696 (2013-6-29 10:30:41)
greenbee (2013-6-29 10:31:11)
大家可以参考下面两篇文献
cuturl('http://www98.griffith.edu.au/xmlui/bitstream/handle/10072/40252/71166_1.pdf?sequence=1')
cuturl('http://ajpendo.physiology.org/content/294/2/E345.full')
shanzhapia696 (2013-6-29 10:31:38)
QUOTE:
我跑骨骼肌b-actin跑了2次，几乎不显。。。shanzhapia696 (2013-6-29 10:32:45)
这篇文献里的条带还可以分割开啊，我寡闻了
fei1226com (2013-6-29 10:33:20)
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这个确实有点过分，呵呵。不过根据我自己做的和别人做的betaactin肯定是可以再骨骼肌中检测出来的，而且非常非常多。
shanzhapia696 (2013-6-29 10:33:48)
QUOTE:
您好，是western检测到的吗？ 我查看b-actin说明书貌似有说心肌和骨骼肌不能用b-actin作内参，请问你用的哪个型号哪个公司的b-actin,产品lagua123 (2013-6-29 10:34:25)
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那我也不知道怎么提高了，不过有时候抗体浓度过高或者是样品丰度太高是也会出现条带消失的情况，因为二抗消耗底物的速度太快，根本等不到曝光就已经萃灭了，我们实验室以前碰到过这种情况。
lagua123 (2013-6-29 10:35:14)
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客气了，我做的是western blot啊，文献上的图片也是WB的啊。我用的是个国产的一个公司的
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