【求助】请大家分析一下PCR结果的原因

最新回复

• 中国特色 (2015-4-01 17:07:09)

  
  是不是循环次数太多了啊？

• 北风那个吹 (2015-4-01 17:07:42)

  
  有可能是产物浓度大，琼脂糖检测时就会在目的条带附近发白！

• 北风那个吹 (2015-4-01 17:08:01)

  
  可能是产物浓度大，电泳时就会在目的条带附近有发白的东西！

• 二丫头466 (2015-4-01 17:08:21)

  QUOTE:

  原帖由 中国特色 于 2015-4-1 17:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  是不是循环次数太多了啊？

  我的最终目的是为了做qPCR，我用的是文献上的方法和引物。这个gel跑了35个循环，其他的文献里面还介绍了40个循环。

• newway (2015-4-01 17:08:37)

  
  文献里的PCR产物电泳图清楚吗？你可以减少到30个循环试一试，还有就是引物设计的问题，详细检查

• #甜# (2015-4-01 17:08:55)

  
  引物设计是不是特异性不好？

• txwuyan (2015-4-01 17:09:10)

  
  Mg+浓度高了？

• 二丫头466 (2015-4-01 17:09:35)

  QUOTE:

  原帖由 txwuyan 于 2015-4-1 17:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  Mg+浓度高了？

  我用的是Taq mix跑的！

• summerxx (2015-4-01 17:10:23)

  
  酶切选择可能不好

• 阿司匹林 (2015-4-01 17:10:55)

  
  引物特异性不是很好吧，你可以切胶回收，杂带没有影响

• 白白的 (2015-4-01 17:11:16)

  可以减少一下底物浓度

• ilovegaga (2015-4-01 17:11:35)

  这种情况我经常遇到。楼主可以尝试提高退火温度，并伴随适当延长退火时间，看你的条带很亮，可以适当的减少几个循环，或者减低模板量，要是还不理想，建议楼主做一个降落pcr，这个效果不错，很大程度能够减少非特异性条带，希望对你有帮助

• 园丁## (2015-4-01 17:11:52)

  有可能是浓度太大了，试一下浓度减小些，或者循环次数降一下
  

• 黄花菜 (2015-4-01 17:12:12)

  可以试下那个CHO49的酶切一下，大概30个cycles就基本够了......

• vvmmoy (2015-4-01 17:12:30)

  
  非特异性扩增，退火温度你可以设置一下梯度

• abc816 (2015-4-01 17:29:48)

  可能有非特异性扩增，可以把杂带回收测序验证一下

• 分子式 (2015-4-01 17:30:15)

  
  请采用高保真酶

• whitesheep (2015-4-01 17:30:31)

  
  降低mg离子浓度和提高退火温度

• 66+77 (2015-4-01 17:30:51)

  可能是模板浓度高了，也可能循环次数偏多。

• 二丫头466 (2015-4-01 17:31:43)

  这是我最近跑的，之前试过降落PCR但是效果不是很明显。这个胶1-3是DNA稀释10倍加量分别为0.5,3,5ul，4-6是稀释20倍加量是0.5,3，5ul。PCR用的25ul体系是taq酶0.25ul，buffer2.5ul，dNTP0.5ul，引物加了0.5ul（10uM）。引物分别是：mlas 5 -GGTGGTGTMGGDTTCACMCARTA-3  mcrA-rev 5-CGTTCATBGCGTAGTTVGGRTAGT-3。PCR条件：95度 5min ， 95度 30S， 55度 45S，72度30S，72度10min，35个循环。引物是文献里面介绍的对我的目的条带特异性最好的引物，因为是要做qPCR所以不能做2次PCR。我的目的条带在480bp左右。另外我用的另一种引物也是同样的结果，DNA模板是用试剂盒提的土壤DNA。所以我个人认为是PCR体系的问题，请大家帮帮忙分析一下。