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质谱和蛋白质组学:击中目标

2008.8.15

Nature Methods - 5, 741 - 747 (2008)   作者:Nathan Blow   分析测试百科  译

    近年来,质谱仪大幅提高了动态范围和灵敏度,使研究者们在疾病生物标志物的发现和验证方面,更从容地面对挑战。

    在2008年6月的美国质谱大会(ASMS)上,用于鉴定蛋白质生物标志物(指示了疾病或疾病状态的蛋白质)的质谱仪,成为了在质谱制造厂商中反复出现的一个主题。

    Waters公司(美国,马萨诸塞州,Milford)推出了一款名为Xevo TQ MS的三重四极杆质谱仪,及其相应的软件包,两者都是为推动生物标志物从发现阶段到目标蛋白的验证阶段而设计的。安捷伦科技(美国,加州,Foster市)推出了新的6400系列的三重四极杆液质联用仪,并提高了灵敏度。“在串联质谱上做验证的优势是提高了动态范围和灵敏度。” James Langridge,Waters公司蛋白质组学业务发展部主任说。

    “我认为我们正处在一个大有希望的时期,利用质谱来发现新的疾病生物标志物。”来自于圣地亚哥Sidney Kummel癌症中心的 Jan Schnitzer说。但对于挑战性的任务,如在血清和血浆等复杂样品中发现生物标志物,仪器的动态范围和灵敏度仍有局限。“血液的复杂性在于,其中存在比几百种蛋白多得多的蛋白;当你深入分子多样性的水平时,它过去是,现在在一定程度上仍然超出了我们的研究手段。” Schnitzer说。为规避这些限制,研究者们日益转向发展新型方法和有针对性的方法,更有效地使用仪器。

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最近,Thermo Scientific在他们的Orbitrap系统上增加了MALDI和电子转移解离(ETD)

缩小范围

    “我认为现有仪器的动态范围大概为104。” 德国Martinsried马普生物化学研究所的Matthias Mann在谈到当今的各种质谱仪时说。然而,人血浆或血清的蛋白,估计大概跨越12个数量级的浓度范围。

    从仪器方面,似乎没有简便的方法来增加动态范围。“我看不到任何机会去获得108或1010,这超出了当今技术的范围。” Mann说。Waters公司的Langridge认为,质谱仪的动态范围可能被已使用的离子化技术所限,如电喷雾离子化只具有5个数量级的动态范围。

    近期看来,仪器本身无法提升至覆盖全部的浓度范围,研究者们正在制订方法来绕过这个问题。一开始,Mann指出,一些简单的样品制备方法,比如选择性地捕获某些蛋白类别来分析,或去除丰度最高的蛋白,都会帮助扩展现有仪器的动态范围。“如果仪器能力有限,你唯一的选择是分解所有的部分,然后进行分析。” Schnitzer说。

 

把复杂度降到最低

    一种有效同时简单的方法,就是在疾病生物标志物的研究中,处理那些较少挑战性的样本。“分析血浆蛋白质组非常困难,” Mann说,“但对于组织来说,我认为前景不错,你可以利用现有的技术分析。” 组织样本覆盖的蛋白浓度范围不像血浆那么宽,并有其它潜在的优势。“人们相信组织更接近于疾病作用的位点,因此,组织中标志物的浓度水平潜在地会更高。” Waters公司的Langridge说。

    仪器的制造商们,对于这种潜在的新途径,已经开发了新的系统,直接进行基于质谱的组织分析。布鲁克道尔顿公司(德国不莱梅),开发了Ultraflex III 型MALDI TOF/TOF系统,专门为组织成像设计,涵盖了蛋白的质量范围。今年早些时候,赛默飞世尔科技(美国马萨诸塞州,Waltham),推出了MALDI离子源的LTQ Orbitrap质谱仪,也能被用于组织成像研究。

    布鲁克道尔顿公司MALDI应用开发和蛋白质组学部主管Detlev Suckau,和其他的科学家一同工作,使用基于质谱的组织成像技术鉴定了生物标志物。Suckau的方法是,首先用Ultraflex III TOF/TOF系统获得一组组织图像,然后对组织样本进行分级的聚类,然后对每个类内的健康态进行病理学分配(assignments),最后用这些分配鉴定这些组的标记。

    “令人吃惊的是,在如此短的时间内开发出智能的候选标志物预测方法,” 他强调,速度远远快于使用血清样本获得相等程度确定性的速度。不过他认为,由于基于质谱的、用于生物标志物发现的组织成像技术刚用于研究1~2年,所以评判它的技术潜力可能还为时过早。

 

直达目标

    一些研究者,如Ruedi Aebersold,还没有放弃对在血清样本中寻找癌症生物标志物的挑战,但这需要更多的工作。在比较病人和健康人个体的整个血清样本的试验中,Aebersold发现,质谱不足以测到必要的ng/mL浓度,或者如果可能的话,需要大量的努力,并要求多台质谱运转——花费数百小时的机时——才能完成仅对两个样本的比较。“我得到的结论是,这条路不可行,” Aebersold说。

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Waters公司新的Xevo TQ质谱是为辅助生物标志物验证的过程而设计的

    然而,他的研究组正在开发“目标蛋白质组”的方法来进行蛋白生物标志物发现。“我们会有目标地看看那些我们认为可能与疾病相关的、特定的蛋白质或蛋白质系列,” 他们最初使用独立的方法,比如微阵列,文献检索和系统级分析,在染病的和正常的个体间比较分析,从而鉴定候选的蛋白质。他们用三重四极杆质谱的多反应监测(MRM)方法,来检测和定量血清样本中蛋白质的系列——寻找病体和正常样品之间的差别。使用MRM,研究者们“指挥”仪器专门监测被选择的离子质量,而忽略了其它离子,这样的检测分析选择性强、灵敏度高。

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Matthias Mann认为,使用无需同位素标记(Label-free)的方法进行质谱定量,有助于生物标志物的发现。

    当然,使用这种目标的方法,你仅能发现你专门去寻找的那些生物标志物,但好处是减少了被质谱测定的蛋白的数量。“你消除了大量的噪音——人对人的噪音和其它的噪音——因为你没有去测定大部分的蛋白,”Aebersold说。目标物的质谱方法,比非目标物的发现-比较方法,灵敏度获得了量级的提高,特别是当面对如血清这种非常复杂的样本时。

    相似的,美国国立癌症研究所实施的癌症的临床蛋白质组学技术(CPTAC)计划,也资助于那些目标的、候选蛋白为基础的方法。 “候选蛋白为基础的方法更稳健、定量更准确,”Steven Carr说,他是美国马萨诸塞州剑桥Broad研究所蛋白质组学平台的主任,和CPTAC的研究员。在优先独立观测的基础上,CPTAC和癌症研究的团体一起工作,鉴定了和癌症相关的大约1,000种候选蛋白生物标志物。这些候选物的子集,将被CPTAC参与者开发的高通量验证方法来测试(见附录:BOX1)。

    新推出的三重四极杆质谱和软件,可能帮助扩展目标物方法的用途。Waters公司的Xevo TQ质谱特点是:在实验中做串联质谱(MS/MS)采集,同时获得定量的MRM数据,这在先前的串联质谱上是不可能的。这种功能,使用户可以根据MS/MS选择感兴趣的蛋白,然后在同一次试验中对感兴趣的离子进行MRM分析。系统利用了新的“VERIFYE'”软件和Xevo TQ 质谱的优点,监测MS/MS分析中产生的所有的肽和蛋白,然后在目标物的方法中找到离子化和断裂最强的碎片进行监控。

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新的软件和工具,比如赛默飞世尔科技新推出的Proteome Discoverer,使质谱数据的解析对用户来说更容易。
 


数字游戏

    “我认为质谱定量是一个非常令人兴奋的领域,过去的几年,在标记和非标记方面都取得了很多成果。” 布鲁克道尔顿的Suckau说。在蛋白质组学研究团体中,质谱定量方法的崛起,是近年来厂商努力工作的结果,他们为研究者们开发了标记和非标记的方法及试剂盒。

    在“标记方面”,赛默飞世尔科技推出了新的串联质谱标签(tandem mass tag)试剂盒,叫做TMT,用于标记实验。TMT是位于英国Cobham的Proteome Science公司发明的。TMT包含带有氨基活性基团的等量的串联质量标签,一个质量归一化的连接子,一个可断裂的化学键,和报告离子(reporter ion)系列。使用这些试剂,研究者们能够在一个样本中专门标记肽和蛋白,然后进行相对或绝对的定量。

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相关链接:TMT试剂盒的介绍

    在“非标记方面”,Mann直接指出,仪器的进步像催化剂一样使定量方法日益流行。“我们有适于应用非标记方法的Orbitrap;和同样具有良好分辨率的先进的TOF质谱;这是很好的一步,” Mann说。“通常我认为非标记方法非常有趣,尤其在生物标志物发现的环境背景方面。”
 
    Lester Taylor,赛默飞世尔科技质谱和生命科学团队的市场总监,指出了分辨率的重要性。“有大量的仪器提高了质量准确度(指对一个质量能测得多准),但只有质量准确度是不够的。关键之一是要有足够的分辨率(指分开两个质量的能力),这样你才能确信你正在监测的峰和其它干扰已经很好地分开。” Taylor说。

    Aebersold的小组使用了标记和非标记两种方法用于目标物蛋白质组研究。他的团队倾向于使用ICAT或iTRAQ标记来进行潜在的生物标志物的验证。“对于检测血清中的目标多肽,我们使用了ICAT标记参比肽,以确定血清蛋白的绝对量,” 他说,“原因很简单,你要准确地定量样品中的多肽,并读出绝对的浓度。” 但在最初的发现阶段,他们使用非标记的方法来建立他们感兴趣的蛋白列表,因为非标记方法花费较低,并具有更高的通量。

 

验证和超越

    “ 你必须分析大量的样本,才能知道一个生物标志物是否具有临床用途。” Langridge说,并谈到蛋白生物标志物验证的另一个问题:完全的样本数目。因为人类种群的多样性,对候选蛋白生物标志物进行统计学的有效验证,可能要求研究几百名病人的样本。然而在开发阶段,验证必须的高分辨率仪器往往不适合高通量工作。

    Carr认为这样的通量问题会在近几年被解决,通过开发稳健的高通量流水线(pipelines)。他认为在验证阶段大部分的瓶颈,不是来源于质谱本身,而是源于样品制备。CPTAC的成员们,和更多的商业开发者们,正在努力开发新技术,来提高发现和验证过程中所有部分的通量。

表1. 供应商指南:提供质谱仪及配件的公司(见附件)

 

附件:

BOX1 标准和实践

2006年1月,美国国立癌症研究所开始资助癌症的临床蛋白质组学技术(CPTAC)评估项目,一项为期5年、1.04亿美元的计划,用于拓展蛋白质组学技术在临床癌症诊断中的应用。

Steven Carr,位于Broad研究所的一个CPTAC研究组的首席研究员说,蛋白质组学至今仍未对临床诊断做出重大贡献。“技术没有错,而是我们对以下方面缺乏清晰的了解:技术基础上能够做什么、怎样为这样的平台准备最好的临床样本,以及什么样品最适于蛋白质组学研究,” Carr说。这是Carr领导的Broad研究所;纽约的斯隆-凯特林癌症中心的CPTAC研究组;印第安纳西拉法耶特的普渡大学;加州大学伯克利分校;田纳西州纳什维尔的范德比尔特大学医学院,共同创建的一个标准化流水线,用于蛋白质生物标志物的发现和验证。

这5个CPTAC小组合作,跨实验室测试样品,在两个领域内建立标准化的程序:非歧视地发现蛋白质组,和用MRM技术进行候选物的验证。通过保持所有他们有可能一致的条件——质谱系统,工作流程和标准操作程序——这5个研究组系统地研究了产生偏差/变化的来源。“关于非歧视地发现,研究组将使用多达100个蛋白质添加到复杂的生物背景(比如细胞裂解液)中,看看在不同丰度下,蛋白怎样才能被可靠和重现的检测。在样本之间、各级的特定蛋白质的稳定的差别怎样能够被鉴定(模拟真正的生物标志物发现过程),假阳性率是多少。关于用MRM方法进行目标物验证,我们正在使用稳定同位素标记的多肽,来定量添加到血浆中的蛋白质,并在5个不同的研究组的7台仪器上,建立重现性,线性响应,和检测限。” Carr解释。

CPTAC现在正在进行下阶段的生物标志物鉴定工作:大规模水平上的验证流水线。来自华盛顿特区的血浆蛋白质研究所的Leigh Anderson说,流水线必须是稳健的,能够被很好地验证。“如果存在一个标志物,我们需要一条流水线,这样我们才有把握去发现它。” 他说,因为他预测在临床验证阶段,候选物大概有95~98%的筛出率。

Anderson 和Carr都认为,在验证阶段最大的挑战来源于如何对待现有质谱仪器有限的灵敏度。他们指望着仪器制造商能提供灵敏度提高5~10倍的系统,来帮助解决问题。

英文原文:Mass spectrometry and proteomics: hitting the mark

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