【求助】蜂种分子鉴定中PCR后跑电泳条带...

最新回复

• bgf5 (2015-4-29 17:04:16)

  
    
  图2 新配TBE  1倍琼脂糖

  
  水田螟黄（MC3、MX2）、豆田螟黄、萝卜螟黄.jpg

• bgf5 (2015-4-29 17:04:34)

  图3新配TBE  2倍琼脂糖

  
  DMC1...DMC6(螟引)新配TBE.jpg

• bgf5 (2015-4-29 17:04:57)

  图5 pcr中退火55度

  
  玉米螟YC1、YC2、...YC13 YX1、...YX7（玉引）.jpg

• bgf5 (2015-4-29 17:25:52)

  请问：
  1、出现条带了，但有拖尾是什么原因；如图4
  2、没出现条带或者部分出现模糊条带，但每个样子的电泳路径上有明显的白色是什么原因；如图2和3
  3、图1中没有条带，而且明显从梳空开始有明显不同于其它图的白色，什么问题；
  4、图5中在应该出现条带的位置上下出现明显的白色，提高退火温度和增加琼脂糖浓度到1.5倍、2倍仍然如此，为什么？
  
  请大侠们帮我详细解答下，灰常谢谢！！！

• dog002 (2015-4-29 17:26:10)

  额，可能是退火温度的原因吧

• dog002 (2015-4-29 17:26:26)

  每一次电泳时PCR条件都不一样么？退火温度做个梯度吧？

• remonte (2015-4-29 17:26:44)

  
  点样孔放在上面吧，看起来很不顺
  DNA有蛋白质污染，引物好像不合适，有二聚体，DNA有降解，电压会不会太大啦？
  

• bgf5 (2015-4-29 17:27:09)

  QUOTE:

  原帖由 dog002 于 2015-4-29 17:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  额，可能是退火温度的原因吧

  退火温度都是一样的555  

• bgf5 (2015-4-29 17:28:54)

  QUOTE:

  原帖由 remonte 于 2015-4-29 17:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  点样孔放在上面吧，看起来很不顺
  DNA有蛋白质污染，引物好像不合适，有二聚体，DNA有降解，电压会不会太大啦？
  

  谢谢大侠，这个电压下，跑电泳有条带亮的，就是最近几次的电泳跑得出现图片上的问题。

• bgf5 (2015-4-29 17:29:11)

  QUOTE:

  原帖由 dog002 于 2015-4-29 17:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  额，可能是退火温度的原因吧

  大侠，您说退火温度怎么调节 ？？？

• woshi (2015-4-29 17:29:40)

  
  退火温度是你在变性的94度和延伸的72度（这个是Taq酶的延伸温度）之间的那个温度。是根据你设计的引物的特性确定的。
  一般来说退火温度越高扩增的特异性越好，但是相对应的扩增条带量会减少；若退火温度降低则会得到更多的条带，但是非特异性扩增也会有所增加。
  建议楼主可以先看看PCR反应的原理，参考引物的Tm值，设计好PCR温度梯度和反应体系。先摸索最佳扩增条件，若是所有温度都尝试过了，就要开始怀疑是否是模板或引物的问题了。反正每次改变一个参量来一个个排除可能的问题。
  PS:1 电泳记得要加marker
      2 楼主最好将点样孔放在上面
    3 照胶时PE手套最好不要垫在下面，图像会不清晰的