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【讨论帖】用CCK-8测细胞增殖/毒性的疑难解答
各位好~【讨论帖】用CCK-8测细胞增殖/毒性的疑难解答
发现大家有很多关于CCK-8的问题，
这方面虽然算不上专家，
但还是有一定经验，
想着这边开一个整合的帖子，
如果大家有遇到相关实验上的问题，
都可以在帖子中回复我，
我会抽时间给大家简单简答，
交流的同时顺便学习，
希望能够帮到大家！
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【讨论帖】用CCK-8测细胞增殖/毒性的疑难解答
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ukonptp (2016-3-12 15:47:59)
在没有使用过CCK-8或者没有用CCK-8做过手头的细胞是，通常会建议做一个预实验摸条件，预实验的概念和标准曲线是相仿的，但不完全一样，这个我会在之后点出来，那么，怎么去做预实验？
我以Hela细胞举例子，
1.准备4块96孔板，每块板上都接种5个梯度的细胞数量，例如：5000、10000、15000、20000、25000，每个细胞数量做3个复孔
2.37°培养箱培育，一般贴壁细胞培养2-4小时，如果悬浮细胞的话可以省去孵育时间
3.每孔加入培养基1/10量的CCK-8，例如，培养基是100微升，那么CCK-8的量为10微升（如果是24孔板或其他规格的孔板，加入1/10培养基的量即可）
4.4块板同时放入孵育箱孵育，1小时后拿第一块板检测OD值，2小时后拿第二块板检测OD值...以此类推，最后我们可以得到4个不同时间段，细胞数量和OD值之间对应的曲线
5.把得到的4条曲线绘制在一个坐标轴上，一般情况下，我们寻找OD值为1时，所对应曲线的细胞孵育条件，例如：OD为1时，可以对应“孵育时间为2小时，接种细胞数为20000”，或者“孵育时间为1小时，接种细胞数为25000”，再或者“孵育时间为3小时，接种细胞数为15000”等，选择其中一种孵育条件，作为之后实验的一个参考标准
那么，这样的一个预实验算是完成了，我们选择的这条曲线，也称为标准曲线。
【有什么问题可以在下面留言，明天会更新实验中遇到关于OD值偏低或者过高的分析以及解决方法】
ukonptp (2016-3-12 15:48:37)
首先是原理：CCK-8的原理我不在累赘重复介绍了，Alamar blue简单说一下，Alamar blue具有一定氧化性，与活细胞中的线粒体酶反应并被还原,还原后染料发生颜色和荧光改变,其深浅与活细胞数量成正比。通过与对照组的比较得到试验组的增殖率,从而测定受试样品的细胞毒性。
我们可以发现两种方法的共同点：被检测细胞都要求是活细胞，死细胞其体内脱氢酶和线粒体酶的活性均受影响甚至失活，无法用这两种方法检测（这边插一句，要检测死细胞数量，可以利用检测上清液中LDH含量，跟对照组对比获得死细胞的量），另外，肉眼观察反应过后都会有明显颜色的变化
不同的地方是：Alamar blue的结果会分别反映在OD值和荧光强度上，而CCK-8主要集中反应在OD值，也就是说Alamar blue同样适用于荧光显微镜，两种方法参与反应的酶不同，必要时需要取舍，例如做代谢，研究细胞内脱氢酶，这时候并不推荐使用CCK-8，会存在一个背景值吸收的问题，拿来发文章的话，编辑不一定认可这个结果，相反，Alamar blue也会存在这样的情况，总之，酌情选择
操作：细胞悬液的制备包括铺板等前期操作基本相同，在加样的时候溶液和培养基最适比例有略微差别，Alamar blue的working solution和培养基的比例推荐在1:5，CCK-8则推荐在1:10，孵育时间根据具体细胞而定，孵育完成之后，分别检测吸光度
性价比：2个方法都有适合的细胞，适合的体系，排除实验外的干扰因素，CCK-8灵敏度比Alamar blue略高，对于副孔重现的效果更好，相对的，CCK-8的价格较Alamar blue高出0.5-1倍（当然，这边是以同仁的CCK-8举例，如果是国产CCK-8，两者价格没有较大差距）
两种方法都有自己的优劣势，根据自己需要选择最合适的方法，检测增殖，不需要局限于比色法，Brdu 核侵入染色、H3同位素标记、ATP Light 荧光显色...都可以用来检测增殖，就像转染方法，电转、脂质体转、钙转、病毒侵蚀、逆转录侵蚀、腺病毒侵蚀等...扯远了，希望对你有帮助
有疑问的话，可以给我留言
ukonptp (2016-3-12 15:49:06)
细胞种类 接种细胞数量 建议加入 CCK -8试剂 后培养时间
1 A549 (人肺癌) 8,000/孔 2-3 hr.
2 AGS 10,000/孔 2 hr.
3 ASTC-a-1 50,000/孔 3.5 hr.
4 B16 (黑色素瘤) 4,000/孔 3 hr.
5 Balb/c 3T3 10,000/孔 4 hr.
6 Bcap-37 (人乳腺癌) 5,000/孔 4 hr.
7 Bel-7402 (人肝癌) 5,000/孔 2 hr.
8 CTLL-2 16,000/孔 3 hr.
9 EaHY926 20,000/孔 2 hr.
10 ECV304 (人脐静脉血管内皮细胞) 20,000/孔 2 hr.
11 HaCaT 10,000/孔 4 hr.
12 HAEC 10,000/孔 4 hr.
13 HEK-293 5,000/孔 2 hr.
14 HepG2 (人肝细胞癌) 2,000/孔 2 hr.
15 Hela (人宫颈癌) 2,000-25,000/孔 2 hr.
16 Ho-8910 (人卵巢癌) 80,000/孔 3 hr.
17 HL60 (人原髓细胞白血病) 30,000-45,000/孔 3 hr.
18 HLF 10,000/孔 1 hr.
19 HS 766T (人胰腺癌细胞) 100,000/孔 2 hr.
20 Huh7 100,000/孔 2 hr.
21 HUVEC 5,000/孔 4 hr.
22 Hepatocytes (肝细胞) 30,000/孔 2-3 hr.
23 HSC 10,000/孔 3 hr.
24 K562 40,000/孔 6 hr.
25 L1210 (小鼠淋巴白血病) 200,000/孔 3 hr.
26 L929 (小鼠成纤维细胞株) 10,000/孔 4 hr.
27 MCF-7 (人乳腺腺癌) 10,000/孔 2-3 hr.
28 MN9D 5,000/孔 4 hr.
29 NIH3T3 10,000/孔 1-2 hr.
30 NRK (大鼠肾细胞) 5,000/孔 4 hr.
31 P815 10,000/孔 3 hr.
32 PC12 10,000/孔 3-4 hr.
33 (人胆管癌细胞系)QBC939 5,000/孔 4 hr.
34 Raji (人Burkitt's淋巴瘤) 100,000/孔 5 hr.
35 RAW264.7 (小鼠巨噬细胞) 20,000/孔 2 hr.
36 SD大鼠脾淋巴细胞 3×105-4×105/孔 4 hr.
37 SGC-996 150,000/孔 2 hr.
38 SH-SY5Y 12,000/孔 3 hr.
39 SK 80,000/孔 3 hr.
40 SMC 20,000/孔 4 hr.
41 SMMC-7721 (人肝癌) 1,000/孔 2 hr.
42 SPC-A1 (肺腺癌) 3,000/孔 3 hr.
43 SW480 1,000/孔 2 hr.
44 T-24 (人膀胱变移细胞癌) 80,000/孔 3 hr.
45 Tca8113 10,000,000/孔 4 hr.
46 T淋巴细胞 1×104-1×106/孔 2 hr.
47 U937 200,000/孔 3 hr.
48 Vero E6 30,000/孔 2 hr.
49 Wish细胞 (人羊膜细胞) 30,000/孔 2 hr.
50 7901 15,000-20,000/孔 4 hr.
51 成纤维细胞 1,500/孔 3 hr.
52 大鼠系膜细胞 10,000/孔 2 hr.
53 骨髓间充质干细胞 4,000/孔 3 hr.
54 结肠癌Caco-2细胞 10,000/孔 3 hr.
55 乳鼠心肌细胞 10,000/孔 0.5-3 hr.
56 人成骨细胞 5,000/孔 3 hr.
57 人外周血淋巴细胞 50,000/孔 4 hr.
58 人支气管上皮细胞 2,000/孔 4 hr.
59 神经母细胞瘤 10,000/孔 2 hr.
60 肾小球系膜细胞 1,000/孔 1 hr.
61 树突状细胞 1,000,000/孔 4.5 hr.
62 兔软骨细胞 1,000/孔 3-4 hr.
63 小鼠脾脏T淋巴细胞 2,000,000/孔 4 hr.
64 原代大鼠肝脏细胞 30,000/孔 3-4 hr.
65 原代胃癌细胞 10,000/孔 4 hr.
Bingo！字体间隙不太方便修改，就这样吧！
ukonptp (2016-3-12 15:49:32)
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【CCK-8加入后孵育分别取0.5h，1h，2h，3h测同一板的OD值，之间间隔的时间是放回培养箱继续孵育的；出现我上述差异；不知我这种做饭有失妥当？】
不建议用同一块板做，我简单说明一下，0.5h的时候去检测，结果能够代表孵育0.5h时，细胞生长的状态，但是，再放入培养箱，过0.5h再去检测，其结果并不代表“孵育1小时的细胞生长状态”，因为你忽略了检测的这段时间内CCK-8和细胞的反应，另外，在整个过程中，增加了实验数据稳定的风险，所以我一般会建议准备4块板，同时加CCK-8进行孵育，分别在4个时间段取其中一块板去检测，这样体现的数据更具有代表性，也是尽可能去避免了误差
【论坛里很多人说OD值要为1比较好？这个1是指对照组的OD值吗？】
我举个例子，比如我们做毒性实验，加入的药物对细胞有一个杀伤作用，那么理论上来说，只要加入药物，那么OD值就会比不加药组的OD值要低，所以我们推荐正常组细胞在加入CCK-8孵育过后能够达到OD值为1甚至1.5这样的数值，那么加药组在同等孵育情况下，OD在1或者1.5以下随着药物浓度的增加而逐渐变小，并带有明显趋势，如果正常组的细胞OD值比较小，比如0.5，那么加入药物之后，OD值要比0.5还要低，整体的趋势就拉不开了，这样说可以理解为什么要强调OD值为1的原因么？
ukonptp (2016-3-12 15:50:10)
楼主讲的很详细，赞！经验谈，继续 ...
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【加CCK-8的时候是用排枪吗？】
一般建议用排枪，缩短加样以及CCK-8的时间，保证孵育之前，每个孔的状态一致，如果实验室只有普通的移液枪，也可以，不过尽量保证在短时间内加完。
【10uL的量感觉总是加不准】
无论是排枪还是移液枪，都可以设置加样的量，量程足够的话，设置在10ul就可以了，枪有两档，一般推荐加到第一档就可以了，虽然那样可能整体的量不到10ul，但只要保证整体的状态一致就行，如果加到第二档，很有可能出现气泡或者带走培养液。
【若枪头触及底部，那就应该每加一次cck就换一次枪头了？】
对的，每次加完枪头都会不可避免沾有培养基或细胞或CCK-8，所以建议每加一次就换一次枪头，可以事先准备96孔板固定板，把枪头都摆好，加样的时候就可以快速高效了~
ukonptp (2016-3-12 15:50:31)
对照组：细胞+培养基
实验组：细胞+药物+DMSO+培养基
空白对照组：DMSO+培养基
我的药物用HPLC走过，吸收峰是在 ...
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需要加入DMSO溶解的情况我之前遇到过，实验先设计了一个预实验：
对照组：细胞+培养基
实验组：细胞+培养基+药物+DMSO+CCK-8
Blank1：培养基+药物+DMSO+CCK-8
Blank2：培养基
由于是预实验，这边多设了一个Blank，每个组设了5个副孔，
Blank1主要是观察药物和CCK-8是否有反应，如果OD值偏高的话，
说明药物有一定的还原性，需要在加入CCK-8之前进行清洗并更换培养基的操作。
另外，通过实验组和Blank1的对比，判断在加入DMSO的环境下，
CCK-8是否能够跟药染的细胞反应，如果OD值没有明显差异，
在确保药物已经达到对细胞杀伤的浓度下，可以判断DMSO是否会对反应有影响。
补充的一点是：DMSO溶解药物后，会让药物具有一定的粘附性，预实验是做下来只是让自己心里明白，之后的实验我还是每次都会清洗换液。
希望能够帮到你！
ukonptp (2016-3-12 15:51:10)
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【我现在做悬浮细胞的CCK8，发现比复孔之间OD值相差比贴壁细胞要大很多，甚至>0.5，这个靠增加复孔数或是去除两个最值能解决吗？】
悬浮细胞副孔间差异大的情况，很有可能是2种原因造成的：
1.团聚，某些悬浮细胞在生长时会出现细胞团聚的现象，导致每孔间细胞和CCK-8之间的反应不充分，也就容易使副孔间的OD值拉开差距
2.没有用平板离心机离心，悬浮细胞在加CCK-8孵育之后，建议用平板离心机离心，每孔吸取一定量的上清液至新的96孔板，然后再用酶标仪检测，原因是基于酶标仪的检测原理，通俗一点来讲，酶标仪在每孔底部射出一定波长的检测光，通过光在液体中的折射来读取最后的吸光度，悬浮细胞如果没有经过离心处理，细胞半悬于体系中，容易对光的折射产生较大影响，由于大多是酶标仪在检测吸光度时使用单光源检测，所以为了避免不必要的误差，会使用平板离心机先离心，再移液，达到最后检测的标准
ukonptp (2016-3-12 15:51:34)
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减少细胞数量或者减少孵育时间，都可以操作。
这两个方法都可以控制OD值，OD值如果达到3.0，参考价值会减弱，不知道你的药物是粗增至还是抑制，前者，正常组OD值控制在0.5左右，后者，正常组OD值控制在1.0-1.5就可以了。
ququer787 (2016-3-12 15:52:08)
ukonptp (2016-3-12 15:53:04)
一.实验操作方面
在操作过程中由于疏忽或者不注意影响OD值过低或者偏高是经常会发生的事，这边总结4个小点，也是最容易出现的问题：
1.气泡，气泡对于OD的影响是绝对的，在加CCK-8或者加培养基时，都有可能造成微量气泡，在孵育之前最好先用肉眼观察，如果发现，用枪将气泡吸走，吸的时候尽量注意别把细胞或者CCK-8一起带走，或者可以采用牙签将气泡挑破，之前我的一位老师，比较厉害，把棉线缠在消毒针头上，能够非常容易带走气泡，这个方法也可以供大家参考
2.孔板，这边分开说，一方面，如果是用96孔板测的话，建议周围一圈孔内不要加细胞孵育，因为在孵育时最外圈容易蒸发，导致培养基或者CCK-8减少影响实验，第二个方面，如果不是用96孔板，用24孔或者其他规格，如果其中加入生物材料帮助细胞附着的话，一定要记住在放入酶标仪检测之前，把其中的液体吸出，转移到另外一快24孔板中测OD值，原因是这些材料会影响光线穿透，做出来的OD值可能会异常高
3.指纹，拿孔板的时候一般是建议握板的两侧，而不碰及板底，别以为指纹就不会对OD值影响了，这在不带手套就做的实验的同学来说会经常发生的事，想要结果好，就规规矩矩！
4.加液，建议加CCK-8的时候，枪头45°贴孔的侧壁，尽量加在底部，这样有助于细胞和CCK-8的反应
【当然实验中肯定会发生各种各样意向不到的情况，下周一继续更新，关于实验中遇到关于OD值偏低或者过高的分析以及解决方法（二）】
rxcc33 (2016-3-12 15:54:26)
楼主讲的很详细，赞！经验谈，继续。
555444 (2016-3-12 15:54:47)
全部加完cck后，是不是要用酶标仪震板以混匀每孔的溶液呢？若不是，楼主是如何解决溶液混匀的问题的？
此外，楼主是怎样设置复孔的，一般设置多少个？感觉这个实验最后得出的数据，每孔之间有时差别比较大。
ukonptp (2016-3-12 15:56:00)
全部加完cck后，是不是要用酶标仪震板以混匀每孔的溶液呢？若不是，楼主是如何解决溶液混匀的问题的？
此外，楼主是怎样设置复孔的，一 ...
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【全部加完cck后，是不是要用酶标仪震板以混匀每孔的溶液呢？若不是，楼主是如何解决溶液混匀的问题的？】
不需要震板，加完之后盖上盖子，轻轻拍打孔板即可
【楼主是怎样设置复孔的，一般设置多少个？感觉这个实验最后得出的数据，每孔之间有时差别比较大】
复孔也可以说是平行孔，一般设置3-5个，复孔之间差异比较大的话有很多因素，可能是CCK-8的问题，也有可能是操作的问题，当然也可能是实验设计的问题
prettygirl@ (2016-3-12 15:56:20)
此外，不知楼主实验过程中有没有发现酶标仪测完后，酶标板的某些孔中溶液已不是悬浊液，出现了部分沉淀的现象？
ukonptp (2016-3-12 15:56:40)
之前提到复孔差异大的话有很多因素，举2个例子，细胞在孵育的时候出现团聚，那么就无法跟CCK-8充分的反应，导致复孔之间OD值的浮动；或者，操作的时候引入气泡，无论是做生物还是做生化实验，做过的同学都知道气泡对于实验的影响是非常大的，尤其是要用到酶标仪或者分光光度计检测的时候。
【此外，不知楼主实验过程中有没有发现酶标仪测完后，酶标板的某些孔中溶液已不是悬浊液，出现了部分沉淀的现象？】
这个问题因素也非常的多，不过并不常见，有几个问题要问清楚：
1.是否是加药实验，如果是，对于细胞是抑制还是促进作用？是否做过药物和CCK-8的空白孔？还原性药物会和CCK-8反应，影响测定
2.细胞的类型和孵育条件，即细胞名、接种数量、孵育时间，孵育条件不当或某些特定的细胞，有可能不适合用CCK-8来测
3.培养基中是否含有还原性物质，还原性物质会和CCK-8反应，可能会导致沉淀，解决的办法是在加CCK-8之前换成不含该类似还原性物质的培养基，再进行孵育
4.也有可能是偶然概率，可以不用特意去分析
ukonptp (2016-3-12 15:56:59)
二.实验设计方面
列了几点，大家不满意的地方我可以再补充~
1.药物：加药实验中，一定！请记住，一定要做药品和CCK-8的空白对照，WST法的整个检测原理，就是和细胞中的脱氢酶还原成橙色染料，所以，一旦药物具有还原性，很容易地会和CCK-8相互反应，从而影响实验结果，一般情况下，药物和CCK-8的空白对照，OD值在0.2以下，我们认为两者不会反应，结果中减去其OD值即可（需要按照整体实验结果来看，如果平均的OD值仅0.4-0.6，那么0.2的OD值我们认为是两者反应的结果），如果超出0.2，建议在加CCK-8孵育之前，吸取培养基，并用PBS仔细清洗，再加入培养基、CCK-8进行孵育。
2.培养基：同药物的影响，培养基中如果含有还原性物质，也会影响实验结果，同样，也是做空白孔，OD值如果大于0.2，建议加CCK-8培养之前换不含该类似还原性物质的培养基，有同学会问会不会对细胞状态有影响，不会，普通培养基足以在孵育的这段时间保证细胞的活力；如果培养基中含有酚红等物质，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白对照即可
3.天数实验：有些同学需要做天数实验，会把细胞培养上7-14天，不仅是对细胞的考验，也是对CCK-8的考验，这边有几个关于天数实验的建议，大家可以参考一下，一方面，做天数实验的话，建议做几天实验就用几块板来做，以避免在一块板中做实验引起的污染和误差；其次，确保实验的条件一致，如果第一天是下午3点加CCK-8培养两个小时，5点检测，那么其余几天的几块板的培养时间也必须和第一天一样，3点加CCK-8，5点检测；一般建议，将实验时间缩短到7天来进行，14天实验周期太长，当中的细胞条件很难控制，不利于实验的进行，如果可以的话，还是将实验缩短到7天左右（这条建议给做天数多的同学）；培养基的更换，一般在3天左右的时候可以更换剩余几块板的培养基，以保证养分的供给，因为培养基在3天左右，养分被细胞消耗完了，PH呈酸性，不利于细胞的生长。
【有好几个同学QQ上加我了，讨论了很多，自己也学到很多，明天会继续更，CCK-8和MTT实验内外的比较】
zhenxin (2016-3-12 15:57:25)
二.实验设计方面
列了几点，大家不满意的地方我可以再补充~
1.药物：加药实验中，一定！请记住，一定要做药品和CCK-8的空白对照，WST法的 ...
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有些药物本身会在450nm处有吸收，会造成OD偏高，不一定是因为药物有还原性的问题。
ukonptp (2016-3-12 15:57:49)
QUOTE:
【有些药物本身会在450nm处有吸收，会造成OD偏高，不一定是因为药物有还原性的问题。】这个操作还是比较简单的，无论是药物具有还原性，还是本身具有吸光度，同样进行孵育前换液的操作，记住用PBS多清洗几遍，建议清洗的次数控制在3-5遍，把细胞表面残留的药物洗干净，即使有吸光度，也不会影响接下去的实验，原因是CCK-8不会进入细胞内反应，整个染料形成过程只存在于培养基体系。
zhenxin (2016-3-12 15:58:09)
QUOTE:
"进行孵育前换液的操作，记住用PBS多清洗几遍",如果培养时使用的是细胞悬液，是不是这一操作就不可行了？ukonptp (2016-3-12 15:58:33)
QUOTE:
【进行孵育前换液的操作，记住用PBS多清洗几遍，如果培养时使用的是细胞悬液，是不是这一操作就不可行了？】悬浮细胞如果加入的药物具有还原性或者本身有吸光度的话，需要用到平板离心机，换液之前使用平板离心机离心，吸取上清液，留底下细胞，PBS清洗，再加培养基、CCK-8孵育。
【讨论帖】用CCK-8测细胞增殖/毒性的疑难解答