Nature：合成生物学，细胞内的精准时钟
活细胞通过分子组件来跟踪时间，尽管这些分子组件极易受到不可避免的随机波动影响，但活细胞对时间的追踪非常精确。例如，单细胞蓝细菌中，自然昼夜钟可以追踪一天24小时。这些生物时钟的准确性经过了进化的考验，可以被认为是生物学家Richard Dawkin形容的“盲眼钟表匠”的杰作——Dawkins用这个比喻来说明进化具有创造神奇系统的能力。
然而，进化不是形成生物钟的唯一方法。合成生物学家们通过设计人造基因回路，在活细胞中实现了新功能。合成时钟的精度能够与自然演进的生物时钟相匹敌吗？ Potvin-Trottier 等人在《自然》（Nature）发表文章指出，即使是相对简单的合成时钟回路，准确度也非常高。
Potvin-Trottier等人的工作基于16年前开发的压缩震荡子（repressilator）——一种人工合成的震荡性基因回路。压缩震荡子外加切换开关，表明新的基因回路可以根据活细胞中的模块化基因元件和行为来设计。具体地说，他们的工作证明完全由人工合成的基因回路可以在蛋白质表达中产生动态振荡，从而让细菌周期性地合成荧光报告蛋白。
压缩震荡子的设计非常简单，类似于剪刀石头布的游戏。其关键组分是阻遏蛋白——一种结合到靶向基因附近的DNA序列上，然后阻断靶基因表达的蛋白。一个压缩震荡子搭配三个阻遏蛋白。第一个阻遏蛋白表达增加时，会抑制第二个阻遏蛋白的表达，这会导致第三种阻遏蛋白的表达增加，而第三个蛋白表达增加又会抑制第一个蛋白表达。以此形成循环，产生表达震荡。三个阻遏蛋白中有一个会抑制荧光报告基因的表达。
这种设计形成负反馈。其中一个阻抑蛋白的浓度的增加导致第二个的减少，导致第三个的增加，从而减少第一个的浓度。在数学上，这种回路会产生极限环——一种不衰减、能抗干扰的震荡。然而，由于许多相关的生化参数是未知的，所以研究人员并不清楚回路是否会振荡。荧光报告蛋白的作用就是方便研究人员观测回路是否产生了震荡。当研究人员看到活细胞周期性地“眨眼”时，他们终于放心了。但这些震荡噪音很大，并随时间和幅度产生不同变化。
从那时起，他们设计了各种各样的合成振荡器，尝试了多种组合。但他们始终不明确到底是什么限制了单个细胞内合成时钟的准确性。一方面，增加额外的反馈环路或其它回路可能有助于降低噪音；另一方面，增加额外组件会引入额外的噪音源。
鉴于这些难题，Potvin-Trottier等人决定重新研究压缩震荡子，以查看能否提高精确度。他们操纵基因回路，使用微流控设备分析了单个细菌细胞100多代的行为。他们以这种方式仔细地识别和减轻了回路中的每个噪声源（图1）。
图1 压缩震荡子的设计获得升级。压缩震荡子是一种产生基因表达的周期性脉冲的合成基因回路，其核心成分是三个阻遏蛋白（粉红色、黄色和蓝色圆圈），每个蛋白能与编码另一种阻遏蛋白的基因附近的DNA序列结合（图中相应颜色的基因序列编码相应颜色的阻遏蛋白）。每种蛋白通过这种方式抑制下一个蛋白的表达。其中一种阻遏蛋白也抑制荧光蛋白（绿色）的产生。 a-c，Potvin-Trottier等人对原始回路进行了修改，提高了压缩震荡子的精度。阻遏蛋白的基因和荧光报告基因（a）在同一个质粒上，然后通过细胞降解机器防止蛋白质降解（b），并引入一个“DNA海绵”，包含TetR阻遏蛋白结合位点，以提高TetR发挥阻遏作用的阈值（c）。 d，改进的压缩震荡子以高精度震荡，并能以固定周期合成荧光蛋白。
首先，他们观察到一些噪声的来源是包含荧光基因的质粒的不受控复制。这种噪声可通过把荧光报告基因整合到包含3个阻遏蛋白的DNA质粒环中来去除。
其次，为了加速振荡，最初的设计中，每个阻遏蛋白都要经历主动降解，从而导致阻遏蛋白的水平对细胞内降解机器的变化非常敏感，而报告基因的拷贝也会加剧这种敏感性。降低报告基因的拷贝数，或删除主动降解机器，能够大大提高精确度。
最后，其中以中国阻遏蛋白——TetR对其DNA结合位点具有强大的亲和力，以致于只要达到每个细胞内有5个TetR，靶基因就会被抑制。仅仅丢失几个分子的TetR，就会导致靶基因的重新激活。这带来了极大的不稳定性。为了规避这种影响，研究者们通过引入包含TetR竞争位点的“DNA海绵”质粒来增加TetR抑制的阈值。在原始设计中，这种海绵的作用由包含报告基因的质粒偶然实现。引入不包括报告基因的DNA海绵，有助于进一步提高精度。
总之， Potvin-Trottier等人设计的最精确的回路中，周期长度的标准偏差从平均值的35％降低到约14％，并且能观察到高度抑制的脉冲形状和振幅。这个压缩震荡子合成荧光蛋白表达的脉冲是每14代一次。假设细胞周期为1小时，将需要约7.5天或180个细胞周期，以使细胞群脉冲周期的标准偏差积累到半个周期。这种非凡的精度意味着，即使大量的细胞也能保持同步。实际上，研究者们能够在试管培养物中可视化振荡动力学，并且由于压缩震荡子菌落在培养皿的中央不断向外生长，所以他们能够通过观察荧光环的模式来追踪震荡情况。显然，精度不一定需要回路复杂性，在这种情况下，似乎越简单，精度越高。
升级版的压缩震荡子应该也会引起新的问题。例如，细胞生长速率直接影响振荡的周期，尤其是在阻遏蛋白不经历主动降解的情况下。那么能否在不引入额外噪音源的情况下，使时钟独立于细胞生长？
Potvin-Trottier等人的压缩震荡子可以通过在细胞内靶基因（荧光报告基因）的周期性扰动来实现对自然基因回路的动态分析。同时，压缩震荡子也可以成为更大的合成回路中的一个小模块。例如，在基于细胞的治疗中，药物递送的动力学似乎对药物特异性具有主要影响——升级的压缩震荡子可用于周期性药物释放。
我们可以通过电子和机械系统等一系列手段来消除噪声。但对于基因回路来说，噪音是必不可免的。现在生物学家能在噪音存在情况下合成高精度的细胞时钟，这表明合成生物学家也成为了相当不错的“钟表匠”。
