【讨论帖】 2D PAGE 实例分析：从样本制备到结果分析

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• changlhsyo (2013-5-25 09:20:09)

  
  一、样本制备过程
  
  现象：氨甲酰化横向点系列（见下图）
  
  原因：尿素中有杂质
  
  解决：更换新的尿素或者通过强阳离子交换柱去除异氰酸盐， 这个现象有时候在没有杂质的时候也有少量出现， 但是不会像这种情况这么明显， 但是也表现为一个蛋白质点在水平方向上的系列拖尾， 经质谱鉴定都是同一蛋白。

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:21:09)

  
  现象： 见下图
  
  原因：三氯醋酸-丙酮沉淀所得到的沉淀仅仅用冷丙酮洗了， 而三氯醋酸仍然残留在了沉淀中， 从而影响了结果。
  
  解决：使用90%的丙酮与10%的水配比来洗沉淀， 三氯醋酸-丙酮沉淀是我们常常使用的一种纯化蛋白的方法， 简单， 有效， 所以细节的注意就更为重要。

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:28:23)

  
  现象： 见下图
  
  分析： 植物蛋白的粗提物杂质比较多， 有一些非蛋白杂质或者糖基化蛋白， 对于2D的分离极为不利， 需要我们通过一些方法来提纯

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:33:41)

  
  现象： 见下图a, b,c
  
  分析： 这3张图是来自于植物蛋白提取物在不同的处理方式之下所跑出的2D图谱，a图是没有经过沉淀的植物蛋白粗分直接用裂解液溶解后得到的2D图谱（w/o =without）大家可以看到，由于植物蛋白中的杂质比较多， 所以背景很深， 这个情况在做水稻和拟南芥等样本的时候常常能够遇到。b图是经过甲醇沉淀的样本， 大家可以看出背景有一定的减弱， c图是经过TCA-丙酮沉淀的样本所跑出的2D，蛋白质点展现最佳， 所以大家在处理样本的时候如果是植物样本， 可以考虑沉淀一下，一般能够达到更好的效果。

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:34:05)

  
  现象： 见下图 a,b
  
  分析： 这里是另外一种我们常见的纯化粗蛋白的方法--2D CLEAN UP KIT， 我这里并不是给GE做广告， 因为确实是我自己用到的方法。其实2D- CLEAN UP是一个很好的方法， 但是重点在于处理完以后你的又白又漂亮的蛋白怎么办？ 这个就和你的样本中可溶性蛋白的含量多少有关了， 如果你是全细胞组分， 或者分泌性的含比较多的可溶性蛋白的样本用裂解液能够很快溶解掉， 但是如果你做得是比较单一的成分或者杂质和疏水性成分比较多的样本， 那么在提纯后， 去杂质除掉一部分， 然后再溶解也要丢失一大部分， 自然会感觉样本损失很大了。
  
  怎样改进你的样本在2D- CLEAN UP KIT 处理后的溶解性呢？ GE的工程师给了以下几点建议：
  
  1. 延长裂解液溶解时间数小时(或者过夜)
  2. 小心的超声波助溶(一般是5/5， 避免样本过热， 同时在水槽中加冰袋)
  3. 冰冻的沉淀物直接投入室温的裂解液中有助于溶解
  4. 使用含SDS的强力裂解液

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:34:41)

  
  现象： 盐离子的干扰，见下图
  
  分析： 样本是 E. coli extract ， 用的是pH 4-7的窄范围IPG胶条，其中左图没有盐离子干扰， 右图有30 mM NaCl的存在， 我们一比较就明显的看的出， 右图的横纹非常的明显。 这就需要我们在样本制备过程中非常注意盐的干扰， 通过沉淀， 纯化等方法首先去除掉盐， 如果已经在裂解液中了， 那么在实验过程中采用杯式上样或者盐桥都可以一定程度上减少盐的影响。

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:40:32)

  
  现象： 盐离子干扰， 见下图
  
  分析： 使用的材料是cell line, 用的是IPG 3-10的线性胶条， 但是过程中电压上不上去， 而且结果中蛋白质点都堆积在了一起， 原因是在裂解之前洗细胞的PBS平衡液没有沥干净， 从而带了大量的盐离子进入了样本。 所以我们在实验过程中要注意吸干净， 或者采用相对来说盐浓度低的D-HANKS缓冲液和山梨醇溶液来洗细胞。

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:40:57)

  
  现象： 盐离子干扰， 见下图
  
  分析： 使用的材料是cell line, 用的是IPG 3-10的线性胶条， 但是过程中电压上不上去， 而且结果中蛋白质点都堆积在了一起， 原因是在裂解之前洗细胞的PBS平衡液没有沥干净， 从而带了大量的盐离子进入了样本。 所以我们在实验过程中要注意吸干净， 或者采用相对来说盐浓度低的D-HANKS缓冲液和山梨醇溶液来洗细胞。

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:41:24)

  
  *2D样本处理小结
  
  这张图的主要目的是让大家比较一下样本处理对2D实验结果是多么的重要。以下的3张图是来自于第3龄的果蝇幼虫的蛋白抽提物的三种不同的处理方式所得到的2D图谱。 胶的上样量是基于同样数量的样本， 而不是基于同样的蛋白量。第一向IEF使用的是pH 3-10 线性胶条，水化液为8 M urea, 2% CHAPS, 0.5% IPG buffer, 65 mM DTT
  
  左图展现的是幼虫匀浆以后直接加入 8 M urea, 4% CHAPS以及PMSF作为蛋白酶抑制剂来裂解。 这是一个比较标准的样本制备过程， 但是从图上可以看出， 2D的结果并不好， 背景太深， 蛋白质点的分布和分离的情况也不好。
  
  中图展现的是将幼虫匀浆以后使用2%的SDS裂解， 并且随后在95°下加热3分钟处理得到的图谱。 虽然有SDS的存在， 但是2D的展现很好， 点分离清楚， 并且在垂直的分子量水平上和水平的等电点上都得到了很好的展现。
  
  右图展现的是将所提取的蛋白用TCA和丙酮沉淀以后再在尿素和CHAPS中重悬， 这个同样是一个我们常常使用的技术手段。 蛋白质点的分辨率很好， 但是总的蛋白质量却比较低， 这个造成的原因可能是沉淀后的蛋白没有能够很好的完全溶解所造成的， 这个情况在2D CLEAN UP KIT的使用过程中也常常出现。

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:41:47)

  
  二、其他2D结果的实例分析
  
  现象： 高丰度蛋白过饱和，见下图
  
  分析： 这个现在在银染的过程中比较常见， 荧光染中间有时候也有， 银染的过程不是线性的比例过程， 如果开始某些蛋白质结合的显色颗粒多的话到后面就会越来越浓， 从而严重影响胶图的展现和结果的分析。 为了解决这个问题我们必须减少上样量或者采用考马斯亮蓝染色这种动态范围比较宽的染色方法。最近BIO-RAD推出的一种ProteoMiner™ Protein Enrichment 技术对于解决这种高丰度蛋白过饱和现象也有一定的帮助。

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:42:17)

  
  现象： 碱性端大量横条纹， 见下图
  
  分析： 2D的致命弱点之一就是对于极酸极碱的蛋白分析和展现的不利。下图是IPG-strip pH 7.5 - 9.5的碱性条带, 上样量为 80 ug 的鼠肝蛋白. 聚焦到 80 kVh, 16 hours. 碱性端蛋白横纹很多是很正常的， 并不是其他的原因引起的， 所以我们只能尽可能的在条纹中多展现出点来， 推荐使用 DeStreak™ 或者TBP来提高碱性端蛋白的分辨率。

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:42:38)

  
  现象： 碱性端垂直条纹
  
  分析： 使用的是pH 4-7的窄范围梯度胶条， 碱性端出现明显的垂直条纹， 这是什么原因呢？ 其实是正常的， 因为pH 4-7的胶条并不是没有7以上的部分， 只是压缩了而已， 所以这个垂直条纹包括了所有的等电点高于7的蛋白质。

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:43:18)

  
  现象： 碱性端蛋白上样
  
  分析： 使用的是pH6-11的窄范围胶条， 如下图左边是普通的上样槽上样， 而右图是使用了CUP-LOADING上样的， 可以明显的看出杯式上样对于碱性蛋白的分离有着明显的改善， 若再结合上DESTREAK或者TBP能够使得碱性蛋白得到更好的展现（当然现在基本做碱性蛋白和疏水性蛋白都是用管胶或者非胶系统。）

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:43:44)

  
  现象： 横条纹的产生
  
  分析： a,b,c图分别是蛋白质上样过高， 聚焦不充分和过度聚焦所造成的横条纹或者拖尾。
  a.蛋白质上样量过高造成拖尾怎么办？ 我们很难判断出溶解在高浓度的尿素和去污剂中蛋白质的性质。 所以用小胶做预实验是一个不错的选择来确定我们的大胶的上样量和处理方式。
  
  b.聚焦不充分的现象有以下几个:
  - 横条纹主要存在于高分子量区域（解决办法是延长聚焦时间）
  - 横条纹在胶上到处都是 (大量延长 IEF 时间， 而不仅仅是聚焦)
  
  c.过度聚焦的现象有
  - 横条纹主要存在于靠近电极的地方(电内渗现象的干扰)
  - 横条纹存在于某些蛋白的一侧(蛋白质降解的原因) (解决办法是缩短聚焦时间)

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:44:27)

  
  现象： 大量横条纹
  
  分析： 聚焦不够同时盐离子浓度过高。

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:44:49)

  
  现象： 见下图
  
  分析： 在IPG过程中IPG STRIP的瓷条析出了冷凝水造成的后果， 所以在准备的时候要注意先把瓷条自然风干或者烘干。

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:45:14)

  
  现象： 平衡时间对于结果的影响
  
  分析： 在IEF完成之后在向2向的转移过程中平衡非常重要， 有时候可能觉得耽误点时间没关系， 但是一次2条还好， 如果是6条的话， 可能就会不自觉的延长了平衡时间了， 下图就是不同平衡时间对2D结果的影响， 所以大家一定要严格控制好时间， 不然会对结果造成严重影响。 左图是标准时间内完成的， 右图是延长了还原5分钟， 延长了烷基化15分钟之后的后果。
  
  我们还要注意的是1. 不烷基化会怎么样？ 会在2向上造成大量垂直拖尾
  2. 在加入烷基化平衡液之前一定要沥干DTT平衡液， 不然会大为减低效力

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:45:40)

  
  现象： 化学药品质量问题的影响
  
  分析： TEMED过期了的后果; 促进胶凝结的过硫酸铵和TEMED我们平时一定要注意， 特别是过硫酸铵一定要新配的比较好。

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:46:06)

  
  现象： 化学药品质量问题的影响
  
  分析： Tris有质量问题
  

  
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• changlhsyo (2013-5-25 09:46:37)

  现象： 蛋白质点的丢失
  
  分析： 2向蛋白质转移中SDS-PAGE过程中电压过高（18cm的达到或者超过400V）， 如果是ETTAN 6系列的话， 不要在最初的45分钟内超过2W/GEL 。 SDS-PAGE到底是恒流好还是恒压还是恒功率好？ 其实都可以， 不过要看样品特点和胶的浓度而定，恒流电压会慢慢增大恒20mA15%的胶到最后估计要有200V以上了，高分子区带好，低分子区太快，就会比较难看恒压建议分2段，过堆积胶前较低，进分离胶再调高，这样样品在分界线上能被压得很细。

  
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