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• 生物迷 (2015-3-11 21:13:13)

  培养基灌装的培养温度到底是多少？

  
  
  前段时间看了某位蒲友发了个帖子，问培养基灌装的温度为什么要先低温再高温，能不能先高温再低温。刚刚看了这个帖子，心里有些不在意，怎么还有人问这个问题，真是新人。准备回给他，因为大家就是这么做的。但是想想，自己身为版主，一定要以理服人，随便找个资料，教育教育这位朋友，要多查资料，少问问题，自己学会找到解决问题的方法。
  对于验证，首先想到的资料自然是有着验证圣经之称的《制药工艺的验证》（2012年版，中文翻译版），翻开第22章，制剂生产的无菌工艺：组织与验证，培养时间和温度章节（page 365）中，是这么描述的“培养时间及温度在许多公司里面曾经一度是具有更多争议及变化的做法之一（4，11)。所选的方法包括7 天培养后从一个温度转移到另一个温度的多种温度下的培养。人们甚至困惑，是否开始应在一个较高的温度[ ( 3 0 ～3 5 )]培养然后转人较低的温度[ ( 2 0 ～2 5 )] , 或者开始在一个较低的温度培养然后移到一个较高的温度。不管所选的真实条件如何，人们已认识到促生长试验必须进行，这种认识导致采取了一个更广泛的明确的做法，即培养温度可以在20~35内变化，其中还包括1 4天内进行单一温度的培养。假如选择的温度是同样的（通常范围是亇2.5°C)，使用一个培养温度易于进行模拟灌装并伴有良好的促生长结果，是适用的。该做法使方法具有了灵活性，因此可以适应微生物复活的最大可能。”
  
  第23章药用化学品无菌工艺验证，培养检查章节（page 376）的描述是“除了与获得待培养物料相关的复杂性（或者是大量的可以检查的洁净容器或是一个单一的膜过滤器，促生长培养基），培养这些物料是容易解决的。物品放在一个25 ~35  培养箱里（在某个单一的温度，所有的地点在2 .5°以内）培养14天。可以使用替代的培养方法，如果促生长要求能得以满足的话。培养后容器检查使用的方法与最后制剂所用容器的方法相类似，允许使用大规格的容器。在完成检测后，检测中所用培养基的样品应该有其促生长特性的确认。”
  第24章，手动无菌工艺验证，培养时间和温度（page383），中的描述是可采用23章的方法。
  汗，这不科学啊，完全和以往的认知不同啊，要是把这段引用了，不是显得俺经验主义了，但是俺肯定也没记错啊，难道是资料没有找对？嘻嘻，小版我除了肉多兄弟多，就是资料多了，对于工艺验证，权威的技术资料莫过于PDA的指南了，于是俺翻开箱底，找到了PDA22、PDA28及PDA62号报告。
  PDA22号报告（2011年版）：
  7.13 Incubation Conditions
  Prior to incubation, filled APS units should be inverted or manipulated to ensure contact of the medium with all internal surfaces of the closure system before they are incubated. APS units should be incubated for a minimum of 14 days unless supported by another qualified duration/method.The temperature chosen should be based upon its ability to recover microorganisms normally found in the environment or in the product bioburden. A single incubation temperature in the range of 20-35°C may be used (6). Data should be available to show the suitability of the selected incubation temperature to support growth. The selected temperature should be controlled and monitored continuously throughout the incubation period.
  PDA28号报告：
  见附图
  
  PDA 62号报告（2013年版）：
  
  8.10 Incubation Time/Temperature培养时间/温度
  The same incubation methods used for a u t o m a t e d machine-based aseptic processing are appropriatefor MAP and can b e f o u n d in PDA Technical Report No. 22 (6):
  用于自动机械无菌工艺的培养方法也适用于MAP，可以查看TR22：
  Prior toincubation, units should be inverted, and swirled or manipulated to ensure contact of the mediumwith all internal surfaces of the closure system before they are incubated. Process simulation units should beincubated for a minimum of 14 days unless supported by another qualified duration/method. The temperaturechosen should be based upon its ability to recover microorganisms normally found environmentally or inthe product bioburden. A single incubation temperature in the range of 20-35 癈 may be used. Data shouldbe available to show the suitability of the selected incubation temperature to support growth. The selectedtemperature should be controlled and monitored continuously throughout the incubation period.
  在培养之前，灌装的单元要倒装、翻转或者其它操作来保证培养基与密封组件整个内表面接触。工艺模拟的培养基至少培养十四天，除非有其它确认过的时间或者方法。温度的选择基于温度要能使环境常规发现的微生物或产品生物负载的微生物能够复活。可以使用20-35℃范围内的单一培养温度。要有数据说明选择的温度能够支持生长。选择的温度要在培养期间持续控制盒监测。
  
  嗨，真是不看不知道，一看吓一跳啊，可以从PDA的指南中看到，PDA其实并没有规定培养基灌装的温度一定要在两个不同温度下进行培养，如果有培养基促生长的数据，在20-35的温度范围内选择一个温度也是可以的。（汗，上帝保佑老板别看到，俺打的报告建的两个培养室啊）。
  小版是打不死的小强，俺就不信俺错了，记得火星人也写过一篇类似的文章，引用的是PIC/S的指南，俺再看看去：
  PIC/S PI 007-6 RECOMMENDATION ON THE VALIDATION OF ASEPTIC PROCESSES
  2011年1月1日发布
  5.3.1 It is generally accepted to incubate at 20-25°C for a minimum of 7 days followed immediately, or after a first reading, by incubation at 30-35°C for a total minimum incubation time of 14 days. Other incubation schedules should be based on supporting validation data.
  通常在先在20~25°C下至少培养7天，然后在30-35°C的温度下总共培养至少14天是可以的。其他培养计划应当基于支持性的数据。
  小版终于找到了先低温再高温的理论来源了，虽然PIC/S也没有禁止其他的培养条件，但是至少小版不会被老板扣那本来就不多的奖金了。
  小版继续找啊找，终于又在箱底找到一个指南
  Guidance Media Fills for Validation of Aseptic Preparations for Positron Emission Tomography (PET) Drugs 2012年4月，这个指南虽然不是直接针对药品的，但是也有一定的借鉴作用。C. What are the steps involved in a media fill? 下有一段描述。After the final product container is filled and ready for release, it should be incubated in a temperature-controlled incubator. Although USP <71> recommends incubation at 20o– 25oC for the aerobic growth medium, as a practical matter any controlled temperature between 20o and 35oC would work for media fills. However, the “controlled temperature” should be specified in your procedures and be maintained within a range that does not exceed ±2.5 ±2.5oCoC. The incubation period of a media fill should be no less than 14 days and the containers should be examined every 2 or 3 days. 从上面可以看出，FDA和PDA的观点基本一致，都是可以选择20-35度间的一个温度做为培养条件，当然前提条件是必须做了促生长的实验。
  
  
  综合以上，我们可以得到结论：
  1.培养基灌装的培养温度可以在进行完培养基的促生长实验后，选择一个20-35度的温度进行培养，但是培养箱的温度需要控制在 ±2.5oC.
  2.对于培养温度的先后问题，目前除了PIC/S的指南外，没有其他指南明确了先后，先后顺序一样需要促生长实验的结果支持。
  
  俺可以得到的教训是：
  1. 师傅未必都是对的，还需要看教材到底怎么说的，当然一本教材也未必是对的，最好看原始的资料来源或者多看几本教材。
  2. 人云亦云易，探索求真难，希望大家不仅仅是得到答案，在得到答案后，最好再去求个真。

  
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• 生物迷 (2015-3-11 21:14:16)

  高效检漏的各种方法

  
  
  钠焰法 Sodium Flame
  源于英国，中国通行，欧洲部分国家于20世纪70～90年代实行。
  试验尘源为单分散相氯化钠盐雾。“量”为含盐雾时氢气火焰的亮度。主要仪器为光度计。
  盐水在压缩空气的搅动下飞溅，经干燥形成微小盐雾并进入风道。在过滤器前后分别采样，含盐雾气样使氢气火焰的颜色变蓝、亮度增加。以火焰亮度来判断空气的盐雾浓度，并以此确定过滤器对盐雾的过滤效率。
  国家标准规定的盐雾颗粒平均直径为0.4mm，但对国内现有装置的实测结果为0.5mm。欧洲对实际试验盐雾颗粒中径的测量结果为0.65mm。
  随着扫描法的普及，欧洲已经不再使用钠焰法。国内有关部门正在修订原有的国家标准，是废止还是继续使用钠焰法，两种意见的都没有结论。
  相关标准：英国BS3928-1969，欧洲Eurovent 4/4，中国GB6165-85。
  
  DOP法
  　　源于美国，国际通行，中国从未实行过。
  试验尘源为0.3mm单分散相DOP（塑料工业常用增塑剂）液滴。“量”为含DOP空气的浑浊程度。测量粉尘的仪器为光度计（photometer）。以气样的浊度差别来判定过滤器对DOP颗粒的过滤效率。
  对DOP液体加热成蒸汽，蒸汽在特定条件下冷凝成微小液滴，去掉过大和过小的液滴后留下0.3mm左右的颗粒，雾状DOP进入风道。测量过滤器前后气样的浊度，并由此判断过滤器对0.3mm 粉尘的过滤效率。
  DOP法已经有50多年的历史，这种方法曾经是国际上测量高效过滤器最常用的方法。早期，人们认为过滤器对0.3mm的粉尘最难过滤，因此规定使用0.3mm粉尘测量高效过滤器。
  DOP中含苯环，人们怀疑它致癌，因此许多实验室改用性能类似但不含苯环的替代物，如DOS，但试验方法仍称“DOP法”。
  通过改变发尘参数，可以获得其它粒径的DOP液滴。于是就有20年前欧美国家测量超高效过滤器的0.1mm DOP法，有时测量仪器也改为凝结核激光粒子计数器。有些国外厂家曾标出对0.05mm或0.03mm DOP的过滤效率，那都是商业上无科学依据的标新立异。
  测量高效过滤器的DOP法也称“热DOP法”。与此对应的“冷DOP”是指Laskin喷管（用压缩空气在液体中鼓气泡，飞溅产生雾态人工尘）产生的多分散项DOP粉尘，在对过滤器进行扫描测试时，人们经常使用冷DOP。
  相关标准：美国军用标准MIL-STD-282。
  
  计数扫描法
  欧洲通用，美国类似，其他国家紧跟。目前国际上高效过滤器的主流试验方法。
  主要测量仪器为大流量激光粒子计数器或凝结核计数器（CNC）。用计数器对过滤器的整个出风面进行扫描检验，计数器给出每一点粉尘的个数和粒径。这种方法不仅能测量过滤器的平均效率，还可以比较各点的局部效率。
  欧洲人的经验表明，对于高效过滤器，最容易穿透的粉尘粒径在0.1～0.25mm之间的某一点，先确定测试条件最易穿透的粉尘粒径，然后连续扫描测量过滤器对该粒径粉尘的过滤效果，欧洲人将这种方法称为MPPS。美国标准干脆规定只测量0.1～0.2mm区间。
  试验中使用的尘源为是Laskin喷管产生的多分散相液滴，或确定粒径的固体粉尘。有时，过滤器厂商要按照用户的特殊要求，使用大气粉尘或其它特定粉尘。若测试中使用的是凝结核计数器，就必须采用粒径已知的单分散相试验粉尘。
  用计数器扫描一台过滤器需要较长时间。为了节省时间，国外将4组大流量采样头和激光测量装置合为一体，这使检测速度大大提高，但一台扫描台的检测速度仍赶不上一条普通过滤器生产线的生产速度，所以主流过滤器厂经常需要配置数台扫描装置。
  计数扫描法是测试高效过滤器最严格的方法，用这种方法替代其它各种传统方法是大趋势。
  相关标准：欧洲EN 1882.1～1882.5-1998～2000，美国IES-RP-CC007.1-1992。
  
  光度计扫描
  尘源一般为多分散相液滴，如Laskin喷管产生的DOP烟雾。使用光度计对过滤器的全平面进行扫描检漏。这种扫描方法能快速、准确地找到过滤器的漏点。由于尘源为多分散相，而光度计不能确定粉尘粒径，所以这种扫描法给出“过滤效率”没有什么实际意义。
  有些厂家和用户认为，只要对滤纸的品质和规格严加控制，过滤器的效率就已经确定了，因此，仅进行以检漏为目的的扫描就可以保证过滤器的质量。
  光度计扫描检漏的方法没有相应标准可依，但这种方法对生产过程的质量控制很有效，所用的测试设备又相对简单，因此有些厂家目前使用这种方法。光度扫描测试台很容易改成计数扫描台，花些钱将买台激光粒子计数器就可以了。
  
  油雾法 Oil Mist
  原西德，原苏联，中国。
  尘源为油雾。“量”为含油雾空气的浊度。仪器为浊度计。以气样的浊度差别来判定过滤器对油雾颗粒的过滤效率。
  德国规定用石蜡油，油雾粒径为0.3～0.5mm。中国标准规定的油雾平均重量直径为0.28～0.34mm，对油的种类未做具体规定。
  油雾法在德国本土已经成为历史，德国于1993年率先搞出了计数扫描法的国家标准，欧洲标准EN1882就是以德国计数扫描法标准为蓝本制定的。
  虽然中国标准规定可以用油雾法，但国内厂家更愿意使用同一标准规定的另一种钠焰法，只有部分生产滤材的厂家在测量过滤材料时仍使用油雾法。
  相关标准：中国GB6165-85，德国DIN24184-1990。
  
  荧光法 Uranine
  只有法国使用，目前仅限于对部分核工业过滤器的测试。
  试验尘源为喷雾器产生的荧光素钠粉尘。试验中，首先在过滤器前后采样，然后用水溶解采样滤纸上的荧光素钠，再测量含荧光素钠水溶液在特定条件下的荧光亮度，这一亮度间接地反映出粉尘的重量。以过滤器前后样品的荧光亮度差别来判断过滤器效率。
  根据法国标准，发尘装置产生的粉尘粒径的计数平均值为0.08mm，粒径的体积平均值为0.15mm。
  荧光法比较麻烦，测量时要先采样，再清洗试样，然后再到另一处去测量荧光。实际上，法国过滤器厂过去最常使用的是DOP法，而不是自己规定的荧光法，现在法国人又将欧洲标准化协会的计数扫描法定为国家标准，荧光法成了摆设。只有当涉到核级高效过滤器时，为了满足20年前传统客户的要求，他们才使用荧光法。
  相关标准：法国NF X44-011-1972。
  
  其它方法
  变风量检漏。使用标准试验风道，如果降低风量后过滤器的效率降低，则肯定有漏点。在过去的高效过滤器试验方法标准中，经常出现变风量检漏的方法。变风量检查只能判断过滤器是否有漏点，不能对漏点定位。
  发烟检漏。在暗室中，在过滤器上游发烟，用一束强光照射过滤器出风面，当过滤器有漏点时，可以明显地看到漏点处的一缕青烟。这种方法可以准确地对漏点定位，以便进行可能的修补。发烟检漏方法不那么讲究，但十分有效。
  无污染检验。有些客户担心试验用的粉尘污染过滤器，过滤器制造厂不得不在测试时使用客户认为不污染过滤器的粉尘。例如，半导体芯片厂讨厌钠盐、油雾、DOP，他们经常要求制造厂家使用他们认为安全的固体颗粒粉尘；有些制药厂要求直接使用室外大气中的粉尘测量过滤器。

• 生物迷 (2015-3-11 21:17:16)

  生化药物生产过程中控制热原的方法

  
  
  热原是微生物的代谢产物,是微生物的一种内毒素,其主要成分是脂多糖,分子量一般为106 左右。
  去除热原的主要方法有:
  1 高温法。多在250 ℃加热30 分钟以上。
  2 酸碱法。用酸或碱进行处理,破坏热原。
  3 吸附法。常用011 %～015 %的活性炭吸附处理。
  4 层析法。利用离子交换树脂或分子筛凝胶层析处理。
  5 超滤法。使用超滤装置滤除热原物质。
  为了保证热原符合规定,往往要经过多次实验才能选择合适的方法,设计出适宜的工艺路线。在实际产品试制过程中,由于生化药物及基因工程药物多为核酸(核苷酸) 类和蛋白质(肽、氨基酸) 类物质,是微生物生长的优良培养基,控制热原成为一个生产难点。
  控制热原可以从以下多个方面综合考虑:
  1 　在生产全过程中注意控制热原的整体水平
  避免在过程中受到微生物污染可避免引入过多的热原物质。所有的去除热原的方法都是基于热原物质在一定水平下,如果热原污染严重,处理起来就相当困难。
  药品生产的GMP 管理,有效地加强了在生产全过程中对热原的控制。生产环境洁净度的控制、物料存放时温度的控制等,现在生产过程中已能严格执行,而对于时间的控制则往往忽视了。在洁净百级的环境下,环境温度一般要求在18～26 ℃,沉降菌允许3 个P皿(30 分钟) 。在此温度下,蛋白质、核酸类物质有利于微生物的繁殖,也就是说本已是无菌的原料或上一工序已无菌处理的物料,可能出现微生物的生长。因此根据长期的生产经验,要求物料(液) 在处理完毕后进行除菌过滤,而且从物料打开包装进行处理、配制到进行除菌过滤,时间宜控制在3 小时内,如处理后仍需冷藏的物料,则处理过程最好控制在2 小时内。
  2 　用具处理
  一般教科书中所提供的方法对于已洗干净的物品均是适用的。而对于已污染微生物或久置未用的用具则需给予特别注意。即在清洗过程中,先使用一定的化学方法进行除热原处理。如用洗液浸泡15 分钟以上或1 %氢氧化钠溶液煮沸15 分钟(建议
  不使用碳酸钠) ,处理完毕后用无热原水进行清洗。
  3 　选择去除原料、中间品中热原的方法
  对于可能含有热原的原料或中间品,去除热原的方法受到多方面的限制。过酸、过碱、过热都会导致失活、降解、变性;吸附、超滤则导致含量损失、活性下降。常用的方法主要有凝胶过滤法、超滤法、吸附法。
  3.1 　凝胶过滤法
  对于处理量少的样品(如几十毫升) ,在实验室
  条件下,该法较为适用。可根据分子量和化学性质
  选择凝胶(如Sephadex G75) ,凝胶在装柱前煮沸灭菌或用稀酸、稀碱洗涤,配制洗脱液的盐可用高温法除去热原,配液用无热原水(溶剂) ,洗脱液容器的通气口用无菌脱脂棉封口,当用鲎试验法检查层析柱平衡液的流出液内毒素反应呈阴性时,方可进行凝
  胶过滤,过程中温度宜控制在10 ℃以下,过滤时间控制在3 小时内,并根据过滤时间来确定柱体积与上样量。曾测试层析时间为4 小时的蛋白质类物质除热原,热原符合规定。
  3.2 　超滤法
  目前生产上已广泛使用超滤法去除热原,超滤膜截留孔径多选用7000～30000 分子量之间,效果较为令人满意。超滤装置与超滤膜的完整性是该法的关键。超滤前对样品进行预过滤以及超滤后即时进行清洗,可延长超滤膜的使用寿命。
  对于组份复杂的蛋白质、肽类物质,超滤后,将发生一些变化。对于液态制成品,在贮存期内,可能会缓慢出现微量沉淀、白点、白块;对于固态制成品,则可能在溶解时存在微量不溶或白点、白块,从而导致澄明度不合格,这需在工艺中另行克服解决。可能的原因是:超滤前的物质的稳态系统,在超滤过程中部分物质被除去或是除去的比例不同,致使平衡破坏,造成另一部分物质析出而达到新的平衡。
  超滤时还需注意的是pH。滤出液的pH 差值可能变化012 甚至015。另外,待超滤液的pH 不仅对超滤速度产生影响,还直接影响到产品收率、活性。
  3.3 　吸附法
  吸附剂以活性碳最为常用,且成本低廉。活性碳吸附处理热原时的关键在于控制pH 与温度。活性碳的用量为011 %～015 % ,一般不必超过014 % ,用量较大时可分次加入。在使用前,将活性碳在180 ℃烘烤2 小时,一方面使活性碳本身去除热原,另一方面也使得活性碳活化,提高吸附力,使一定工艺条件下吸附力稳定。
  活性碳吸附处理时,料液的pH 应控制在酸性条件下,此时去除热原的效果比较理想。考虑到对产品性质的影响,一般选择pH510～615。如料液终
  点pH > 615 ,在活性碳吸附处理前,先将pH 调到pH615 以下;吸附处理后,去除活性碳,然后再回调pH 至终点pH。如在去除活性碳前就回调pH 至终点pH ,则可能使已吸附的热原物质发生解吸附,从
  而使热原不合格。
  活性碳吸附处理时的料液温度对吸附效果影响也十分重要。如pH610、40 ℃吸附处理20 分钟热原不合格的核酸类料液,于pH610、80 ℃吸附处理20分钟,热原可符合规定。如果料液性质允许,吸附处理的温度可尽量提高,相应的可缩短处理时间;如不宜高温处理,则可降低吸附处理时的pH ,并适当延长吸附时间。
  通过pH、温度与吸附时间、活性碳用量的相互配合,在除去的同时,可使含量损失控制在10 %以内。

• 生物迷 (2015-3-11 21:19:27)

  灭菌大法汇总

  
  
  灭菌法系指用适当的物理或化学手段将物品中活的微生物杀灭或除去的方法。本法适用于无菌、灭菌制剂、原料、辅料及医疗器械等生产过程中物品的灭菌。
  无菌物品是指物品中不含任何活的微生物。然而，对于任何一批灭菌产品来说，绝对无菌是既无法保证也无法被用试验来证实的，因为不可能对每一最小包装的产品进行无菌试验。事实上，物理或化学灭菌方法手段灭菌试验表明：微生物的杀灭曲线遵循对数规则，，因此，所以，批已灭菌物品的无菌性标准一般在概率意义上定义为污染单位低到可接受的程度，一般用以物品灭菌后微生物存活的概率-无菌保证值水平SAL (Sterility Assurance Level)表示。最终灭菌产品产品微生物存活的概率的无菌保证值一般不得低于高于10-6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一。无菌保证值与灭菌物品中存在的微生物数量及特性密切相关，因此在产品生产的各个环节均应采取各种有效的手段(包括过滤除菌等措施)来降低待灭菌产品的微生物污染并控制在规定的限度内。已灭菌产品达到的无菌保证水平可通过验证确定。
  灭菌产品的无菌保证并不能依赖于最终产品的无菌检验，而是取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、严格的GMP管理和良好的全面质量保证体系。灭菌工艺的制定确定应综合考虑其被灭菌物品的性质、灭菌方法的有效性、和经济性及、灭菌后产品物品的完整性和稳定性等因素。
  灭菌程序的验证是无菌保证的重要内容必要条件。对灭菌产品(包括最终容器及包装)而言，；灭菌方法在实际应用前必须对其灭菌程序经进行验证后，方可交付正式使用。验证内容包括：
  ⑴撰写确定验证方案及制定评估标准。
  ⑵确认灭菌设备技术资料齐全、安装正确,并能处于正常运行（安装确认）。
  ⑶确认关键控制设备和仪表能在规定的参数范围内正常工作运行（运行确认）。
  ⑷采用灭菌物品或模拟物品进行重复试验，提供各参数范围，确认灭菌效果符合规定（性能确认）。
  ⑸汇总并完善各种文件和记录，撰写记录完整的验证报告。
  日常生产中，应对灭菌过程程序的运行情况进行监控，确认灭菌过程中各关键参数（如温度、压力、时间、湿度、灭菌气体浓度及吸收的辐照吸收剂量等）均在验证确定的范围内。；已采用的灭菌程序中关键的设备和工艺应定期进行再验证。当灭菌程序发生较大变化发生变更时，（包括灭菌柜中灭菌物品放置装载方式和数量发生的改变）时，应进行重新再验证。
  产品在这种概率意义上的无菌保证并不能依赖于最终产品的无菌检验，而是取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、严格的GMP管理和良好的全面质量保证体系。这意味着批生产过程的监控将比批无菌试验结果更能反映产品的无菌保证水平。产品的无菌保证与灭菌前产品被污染的程度及污染菌的特性相关。因此，应严格监控被灭菌品灭菌前的微生物污染水平及污染菌的耐受性，并在生产的各个环节采取各种措施降低污染，确保微生物污染控制在规定的限度内。
  否则，应采取必要手段降低污染及消除抗性菌株，甚至进行灭菌工艺的重新验证。灭菌后，应防止已灭菌物品被再次污染。任何情况下，都应要求容器及其密封系统确保产品在有效期内符合无菌要求。
  灭 菌 方 法
  常用的灭菌方法有蒸汽湿热灭菌法、干热灭菌法、气体灭菌法、辐射灭菌法和过滤除菌法。可根据被灭菌物品的特性采用一种或多种方法的组合灭菌。只要产品允许，一般应尽可能选用终端最终灭菌法（即产品分装至包装容器后再灭菌）灭菌。若产品不适合采用终端最终灭菌法，可选用过滤除菌法或无菌生产工艺达到无菌保证要求，只要可能，应对非最终灭菌的产品作补充性灭菌处理（如流通蒸汽灭菌）。
  一、蒸汽湿热灭菌法
  本法系指将物品置于灭菌柜内利用高压饱和蒸汽或流通蒸汽灭菌、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。流通蒸汽不能完全杀灭细菌孢子，一般可作为不耐热无菌产品的辅助灭菌手段。高压蒸汽灭菌该法灭菌能力强，为热力学灭菌中最有效、应用最广泛的灭菌灭菌方法。药品、容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其他其它遇高温和潮湿不发生变化或损坏的物品，均可用本法灭菌。流通蒸汽不能完全杀灭细菌孢子，一般可作为不耐热无菌产品的辅助灭菌手段。1. 蒸汽灭菌的有关参数
  (1)D值
  D值即微生物的耐热参数，系指一定温度下，杀灭90%微生物所需的时间，以分表示。D值越大，表明该微生物的耐热性越强。不同的微生物在不同环境条件下具有不同的D值。
  灭菌方法验证时，微生物的耐热参数一般使用D121℃ 。
  (2)Z值
  Z值即灭菌温度系数，系指使某一种微生物的D值下降一个对数单位，灭菌温度应升高的值(℃)，通常取10℃。它被用于定量的描述孢子对灭菌温度变化的敏感程度，Z值越大孢子对温度的敏感性越弱。
  (3)FT值
  FT值系指给定的Z值下，灭菌程序所赋予待灭菌品在温度T下的灭菌时间，以分表示。
  LgP=lgN0- FT/DT
  式中P为灭菌产品中微生物存活的概率。
  N0为产品灭菌前微生物的数量。
  灭菌温度高时，FT值就小，灭菌温度较低时，所需FT值就大。
  (4)灭菌率L
  L值系指在某温度下灭菌1分钟所相应的标准灭菌时间(分)， 即F0和FT的比值(L= F0/FT = D121℃ /DT)。不同Z值、不同温度下的L值是不同的，灭菌率均可查得。
  (5) F0值
  F0值即标准灭菌时间，系指灭菌过程赋予待灭菌物品在121℃下的等效灭菌时间，即T=121℃、Z=10℃时的FT值。121℃为标准状态，F0值即为标准灭菌时间，以分表示。一个灭菌程序的总的标准灭菌时间F0，应包括加热及冷却过程。它可以用灭菌率对时间求积分的方法计算而得。
  F0=∫t2t1L·dt
  式中dt为测定的间隔时间，相邻两次的间隔时间通常取1分钟。
  100℃以下，L值可以忽略。F0是作为灭菌过程中监控物品达到无菌保证的重要手段。现代灭菌器上设置有F0值自动显示系统。
  上述参数及其关系为蒸汽灭菌程序的设计、验证及日常灭菌效果的监控提供了理论依据。

• 生物迷 (2015-3-11 21:19:49)

  灭菌条件及验证的基本要求
  
  高压蒸汽湿热灭菌条件一般通常采用121℃×20min或116℃×40min的程序，也可采用其它温度和时间参数。总之，必须保证物品灭菌后的SAL≤10-6。总之，必须验证所采用的灭菌条件能达到无菌保证要求。在实际应用中，对热稳定的产品或物品，可采用过度杀灭法菌，其SAL应≤10-1212。对热极为敏感的产品，可的允许标准灭菌时间F0可低于8min。，但对F0低于8的灭菌程序要求应在生产全过程中，对产品中污染的微生物严加监控，并采取各种措施防止耐热菌污染及降低微生物污染水平，以确保被灭菌灭菌产品达到无菌保证要求。灭菌物品的表面必须洁净，不得污染有机物质。必要时，外表应用适宜的包皮宽松的包裹，特别是烧瓶、试管等容器的塞子要防止脱落。灭菌柜内的物品装载方式应保证灭菌蒸汽彻底穿透物品，且不影响蒸汽穿透速度和灭菌后的干燥程度。灭菌柜中的空气应排空并被饱和蒸汽完全替代,以保证表压与灭菌柜内压力的一致。
  采用湿热灭菌时[d1] ，被灭菌物品应有适当的包装和装载方式，保证灭菌的有效性和均一性。
  蒸汽灭菌法湿热灭菌工艺验证时，应进行热分布试验、热穿透试验和生物指示剂验证试验。以确定灭菌柜空载及不同装载时腔室里中的热分布状况及可能存在的冷点；在空载条件下，确认121℃时腔室的各点的温度差值应≤±1℃、；使用插入实际物品或模拟物品内的温度探头，确认灭菌柜在不同装载时，最冷点物品的标准灭菌时间（F0）达到设定的标准；用生物指示剂进一步确认在不同装载时冷点处的灭菌物品达到无菌保证水平。本法常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus)。
  二、干热灭菌法
  本法系指物品于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中、利用干热空气达到杀灭微生物或消除热原物质的方法，在干热灭菌柜、连续性干热灭菌系统或烘箱等设备中进行灭菌。可用适用于耐高温但不宜用蒸汽湿热灭菌法灭菌的物品的灭菌，也是最为有效的除热原方法之一，如玻璃器具、金属制容器、纤维制品、固体试药、液状石蜡等均可采用本法灭菌。
  干热灭菌条件一般为160～170℃×120min以上、170～180℃×60min以上或250℃×45min以上，也可采用其它温度和时间参数。总之，应保证灭菌后的产品其SAL≤10-6。干热过度杀菌杀灭后产品的SAL应≤10-12，此时物品一般无需进行灭菌前污染微生物的测定。干热灭菌250℃ 45min的干热灭菌也可除去无菌产品包装容器及有关生产灌装用具中的热原物质。
  采用干热灭菌时，被灭菌物品应有适当的包装和装载方式，保证灭菌的有效性和均一性。
  用本法灭菌的物品表面必须洁净，不得污染有机物质，必要时外面应用适宜的包皮宽松包裹。配有塞子的烧瓶、试管等容器口应有金属箔或纱布等包皮包裹，并用适宜的方式捆扎，防止脱落。干热灭菌箱内物品排列不可过密，保证热能均匀穿透全部物品。
  干热灭菌法验证与蒸汽湿热灭菌法相同，应进行热分布试验、热穿透试验、生物指示剂验证试验或细菌内毒素灭活验证试验。以确认灭菌柜中的温度分布应符合设定的标准、确定最冷点位置、确认最冷点标准灭菌时间（FH）能保证达到设定标准并达到SAL要求。常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)。细菌内毒素灭活验证试验是证明除热原过程有效性的试验。一般将不小于1000单位的细菌内毒素加入待去热原的物品中，证明该去热原工艺能使内毒素至少下降3个对数单位。细菌内毒素灭活验证试验所用的细菌内毒素一般为大肠杆菌内毒素（Escherichia coli endoxin）。验证时，一般采用最大装载方式。
  三、辐射灭菌法
  本法系指将灭菌产品置于适宜放射源辐射的γ射线或适宜的电子加速器发生的电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法。本法最常用的为60Co-γ射线辐射灭菌。医疗器械、容器、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成品等均可用本法灭菌。
  采用辐射灭菌法灭菌的无菌产品其SAL应≤10-6。γ射线辐射灭菌所控的参数主要是辐射剂量（指灭菌物品的吸收剂量）。该剂量的制定应根据考虑产品灭菌物品的适应性和及产品可能污染的微生物最大数量及最强抗辐射力，所使用的剂量事先应验证其有效性及安全性。常用的辐射灭菌吸收剂量为25kGy。对最终产品、原料药、某些医疗器材应尽可能采用低辐射剂量灭菌。灭菌前，应对待被灭菌物品微生物污染的数量和抗辐射强度进行测定，以评价灭菌过程赋予该灭菌物品的无菌保证水平。
  灭菌时，应采用适当的化学或物理方法对灭菌物品吸收的辐射剂量进行监控，以充分证实灭菌物品吸收的剂量是在规定的限度内。如采用与灭菌物品一起被辐射的放射性剂量计，剂量计要置于规定的部位。在初安装时计量剂量计应用标准源进行校正，并定期进行再校正。
  当60Co-γ辐射用于中药非灭菌制剂灭菌以控制其微生物污染水平时，一般最高辐射吸收剂量为：散剂及含原粉胶囊剂3 kGy、丸剂5 kGy、半成品粉末6 kGy。辐射灭菌后的物品，应进行微生物检测，同时应测定中药灭菌辐射前后的主要药效成分是否变化，以确定该方法的安全性和有效性。
  60Co-γ射线辐射灭菌法验证时，除进行生物指示剂验证试验外，还应确认空载和装载时灭菌腔内的辐射剂量的分布图、灭菌物品的吸收剂量及最大和最小吸收剂量的分布、灭菌物品的均一性、灭菌腔内物品的装载方式等。常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus pumilus)。
  四、气体灭菌法
  本法系指用化学消毒剂形成的气体杀灭微生物的方法。在充有灭菌气体的高压腔室内进行。常用的化学消毒剂有环氧乙烷、气态过氧化氢、甲醛、臭氧（O3）等，本法适用于在气体中稳定的物品灭菌。采用气体灭菌法时，应注意灭菌气体的可燃可爆性、致畸性和残留毒性。

• 生物迷 (2015-3-11 21:20:09)

  本法中最常用的气体是环氧乙烷，一般与80％～90％的惰性气体混合使用。该法可用于医疗器械，塑料制品等不能采用高温灭菌的物品灭菌。含氯的物品及能吸附环氧乙烷的物品则不宜使用。另外，使用气态过氧化氢和臭氧（O3）灭菌，因其无危害性残留物，不会对操作人员和环境造成危害，适合于空间和物品表面的灭菌。
  采用环氧乙烷灭菌时，灭菌柜内的温度、湿度、灭菌气体浓度、灭菌时间是影响灭菌效果的重要因数。可采用下列灭菌条件：
  温度 （ 54 ±10）℃
  相对湿度 （60±10）%
  灭菌压力 8×105Pa
  灭菌时间 90min
  灭菌条件应予验证。灭菌时，先将灭菌腔室先抽成真空，然后通入蒸汽使腔室内达到设定的温湿度平衡的额定值，再通入经过滤和预热的环氧乙烷气体。灭菌过程中，应严密监控腔室的温度、湿度、压力、环氧乙烷浓度及灭菌时间。必要时使用生物指示剂监控灭菌效果。本法灭菌程序的控制具有一定难度，整个灭菌过程应在技术熟练人员的监督下进行。灭菌后，应采取新鲜空气置换，使残留环氧乙烷和其他易挥发性残渣消散。并对后通入环氧乙烷残留物和反应产物进行监控，以证明其不超过规定浓度，避免产生毒性。
  环氧乙烷灭菌法验证时，应进行如下试验：泄露泄漏试验，以确认灭菌腔室的密闭性；生物指示剂的验证试验，指示剂一般采用枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)；灭菌后换气次数的验证试验，确认环氧乙烷及相应的反应产物含量在限定的范围内。验证设计时，还应考虑物品包装材料和灭菌腔室中物品的排列方式对灭菌气体的扩散和渗透的影响。
  五、过滤除菌法
  本法系利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去空气气体或液体中的微生物的方法。在开放式或封闭式过滤系统中进行。本法广泛用于制药行业，特别是常用于对热不稳定的药品溶液或原料的除菌。
  除菌过滤器采用孔径分布均匀的微孔滤膜作过滤材料，微孔滤膜分亲水性和疏水性两种。滤膜材质依过滤物品的性质及过滤目的而定。药品生产中采用的除菌滤膜孔径一般不超过0.22μm。过滤器不得对被滤过成分有吸附作用，也不能释放物质，不得有纤维脱落，禁用含石棉的过滤器。滤器和滤膜在使用前应进行洁净处理，并用高压蒸汽进行灭菌或作在线灭菌。更换品种和批次应先清洗滤器，再更换滤膜。
  过滤过程中无菌保证与过滤液体液体的初始生物负载负荷及过滤器的对数下降值LRV(Log Reduction Value)有关。LRV是表示系指在规定条件下，待被过滤液体过滤前的微生物数量与过滤后的微生物数量比的常用对数值。
  即： LRV=lgN0- LgN
  式中N0为产品除菌前的微生物数量。
  N 为产品除菌后的微生物数量。
  LRV用于表示过滤器的过滤除菌效率，对孔径为0.22μm的过滤器而言，要求每1cm2有效过滤面积的LRV应不小于7。因此过滤除菌时，应将待被过滤产品总的污染量应控制在规定的范围限度内。为保证过滤除菌效果，可使用两个过滤器串连过滤，或在灌装前用过滤器进行再次过滤。
  在过滤除菌中，一般无法对全过程中过滤器的关键参数（滤膜孔径的大小及分布，滤膜的完整性及LRV）进行监控。因此，在每一次过滤除菌前后均应作滤器的完整性试验，即气泡点试验或压力维持试验或气体扩散流量试验。测定滤器是否符合已验证过的完整性控制标准，确认滤膜在除菌过滤过程中的有效性和完整性。完整性试验可使用完整性试验仪测定。除菌过滤器的使用时间不应超过一个工作日，否则应进行验证。
  过滤系统的验证包括过滤系统对过滤液体的适应性、过滤材料对溶液的污染程度、过滤器的规格、过滤器的灭菌方法、过滤系统的完整性试验、生物指示剂试验、过滤液体的微生物含量控制及过滤时间、过滤器的使用寿命等。上述试验大部分可由滤器的生产厂商来进行。微生物挑战性试验常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta)。
  通过过滤除菌法达到无菌的产品应严密监控其生产环境的洁净度，建议在无菌环境下进行过滤操作。相关的设备、包装容器、塞子及其它物品应采用适当的方法进行灭菌，并防止再污染。

• 生物迷 (2015-3-11 21:20:27)

  六、无菌生产工艺
  无菌生产工艺系指必须在无菌控制条件下生产无菌制剂（如粉针剂）的方法，无菌分装及无菌冻干是最常见的无菌生产工艺。后者在工艺过程中须采用过滤除菌法。
  无菌生产工艺应严密监控其生产环境的洁净度，并应在无菌控制的环境下进行过滤操作。相关的设备、包装容器、塞子及其它物品应采用适当的方法进行灭菌，并防止被再次污染。
  无菌生产工艺过程的无菌保证应通过培养基无菌灌装摸拟试验验证，试验结果的阳性率不得超过0.1%(置信度取95%)。值不得低于3。因此在生产过程中，应严密监控生产环境的无菌空气质量、操作人员的素质、各物品的无菌性。
  无菌生产工艺应定期进行验证，包括对环境空气过滤系统有效性验证及培养基模拟分灌装试验。
  生物指示剂
  生物指示剂系一类特殊的活微生物制成的特殊制剂品。可用于确定确认灭菌设备的性能、灭菌物品的灭菌程序的建立和有效性的验证、灭菌程序的再验证、供评估产品灭菌是否达到无菌保证要求的依据、无菌空气过滤系统的评估生产过程灭菌效果的监控等。用于灭菌验证中的生物指示剂一般是细菌的孢子。
  选择制备生物指示剂用微生物的基本要求
  不同的灭菌方法使用不同的生物指示剂，制备生物指示剂所选用的微生物必须具备以下特性：
  (1) 菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能被污染微生物的耐受性。
  (2) 菌种应无致病性。
  (3) 菌株应稳定。存活期长，易于保存。
  (4) 易于培养。若使用休眠孢子，生物指示剂中休眠孢子含量要在90%以上。
  1. 生物指示剂的制备
  生物指示剂的制备应按一定的程序进行，制备前，应需先确定所用微生物的特性，如D值（微生物的耐热参数，系指一定温度下，将微生物杀灭90%所需的时间，以分表示）值等。
  菌株应用适宜的培养基（如产孢子的培养基）进行培养。培养物应制成悬浮液，其中孢子的数量应占优势，孢子应悬浮于无营养的液体中保存。
  生物指示剂中包含一定数量的一种或多种孢子，可制成多种形式，通常是将一定数量的孢子附着在无生命的载体上，如滤纸条、玻片、不锈钢、塑料制品等；孢子悬浮液也可密封于安瓿中；有的生物指示剂还配有培养基系统。生物指示剂应选用合适的材料包装进行包装以防止微生物的污染和孢子损耗，，并确定设定有效期。载体和内层包装材料在保护生物指示剂不被污染和损耗的同时，还应保证灭菌剂穿透必须保证灭菌因子易穿透包装内的微生物部位并能与生物指示剂充分接触、不得有任何污染物、在灭菌过程中不被破坏，否则将影响生物指示剂有效性、稳定性及使用。同时载体和包装应设计应原则是便于贮存、运输、取样、转移接种，并能避免这些过程微生物的污染和孢子的损耗。
  有些生物指示剂可直接将孢子接种至液体灭菌物或具有与其相似的物理和化学特性的替代品中。此时必须论证替代品对孢子的生长繁殖没有影响及孢子的耐受力没有降低。使用替代品时，应用数据证明二者的等效性。
  2. 生物指示剂的应用
  在灭菌程序的验证中，尽管可通过灭菌过程某些参数的监控来评估灭菌效果，但生物指示剂的被杀灭程度，则是评价一个灭菌程序有效性更好的最直观的指标。灭菌用的生物指示剂可来源于使用商品化市售的标准生物指示剂，或是也可使用由日常生产污染菌监控中分离的最耐受微生物制备的孢子并经实验室制备而得。在生物指示剂验证试验中，需确定孢子在实际灭菌条件下的耐受性，并测定孢子的纯度和数量。验证时，生物指示剂的微生物用量应比日常检出的微生物污染量大，耐受性强，以保证灭菌程序有更大的安全性。在终端最终灭菌法中，生物指示剂应放在灭菌柜中灭菌因子最不易到达的部位（最冷点）的不同部位。若正常生产中需要用生物指示剂进行灭菌效果监测时，应注意放置方式并避免指示剂直接接触到被灭菌物品。生物指示剂按设定的条件灭菌后取出，分别置培养基中培养，确定生物指示剂中的孢子是否被完全杀灭。
  过度杀菌杀灭产品灭菌验证一般不考虑微生物污染水平，可采用商品化市售的生物指示剂。对灭菌手段耐受性差的产品，设计灭菌程序时，根据经验预计在该生产工艺中产品微生物污染的水平，选择生物指示剂的菌种和孢子数量。这类产品的无菌保证应通过监控每批灭菌前的微生物污染的数量和、耐受力性、和灭菌程序验证所用的生物指示剂数量和耐受力及其他相关的参数获得的数据进行评估。
  3.常用生物指示剂
  (1)蒸汽湿热灭菌法：蒸汽湿热灭菌法最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus，如NCTC 10 007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。D值为1.5～3.0min，每片（或每瓶）活孢子数5×105～5×106个，在121℃、19min下应被完全杀灭。另外此外，还可使用生孢梭菌孢子(Spores of Clostridium sporogenes如NCTC 8594、NCIMB 8053、ATCC 7955)，D值为0.4～0.8min。
  (2)干热灭菌法：干热灭菌法最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis，如NCIMB 8058、ATCC 9372)。D值大于1.5min，每片活孢子数5×105～5×106个。去热原验证时使用大肠杆菌内毒素（Escherichia coli endoxin），加量不小于1000细菌内毒素单位。
  (3) 辐射灭菌法：辐射灭菌法最常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus pumilus，如NCTC 10 327、NCIMB 10 692、ATCC 27 142)。每片活孢子数107～108，置于放射剂量25kGy条件下，D值约3kGy。但应注意灭菌产品中所负载的微生物可能比短小芽孢杆菌孢子显示更大强的抗辐射力。因此短小芽孢杆菌孢子可用于监控灭菌过程，但不能用于灭菌辐射剂量的建立。
  (4) 气体灭菌法：环氧乙烷灭菌最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis，如NCTC 10 073、ATCC 9372)。气态过氧化氢灭菌最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus，如NCTC 10 007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。每片活孢子数1×106～5×106个。环氧乙烷灭菌中，枯草芽孢杆菌孢子D值大于2.5min，在环氧乙烷浓度为600mg/L，相对湿度为60%，温度为54℃下灭菌，60min应被杀灭。
  ⑸ 过滤除菌法：过滤除菌法最常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta,如ATCC19 146)，用于滤膜孔径为0.22μm的滤器；黏质沙雷菌(Serratin marcescens)(ATCC 14 756)，用于滤膜孔径为0.45μm的滤器 。

• 生物迷 (2015-3-11 21:22:17)

  冻干机在线灭菌新工艺

  
  
  GMP（2010版）于2011年3月1日颁布实施，国家食品药品监督管理局要求所有注射剂企业必须于2013年12月31日通过GMP认证，药品生产企业尤其是注射剂生产企业将面临新一轮的考验。
    　　最近一段时间，“冻干机是否必须在线灭菌”这一问题被再一次提出。在GMP（1998版）的认证中就有过一次大讨论，专家们最后的意见是“鉴于国情，对冻干机的在线灭菌不作强制性要求，但企业应对冻干机的无菌进行充分验证”。因此，不具备在线灭菌功能的冻干机均通过GMP（1998版本）认证。世异时移，GMP（2010版）颁布了，您的理念不更新可能麻烦就来了。本着互相学习，共同进步的原则，就冻干机灭菌问题，谈谈本人的认识，不当之处欢迎批评指正。
  1. 冻干机一定要在线灭菌吗？
    　　生产冻干粉针剂的真空冷冻干燥机一定要在线灭菌，而不仅仅是消毒。
    　　最近几年陆续有一些生产冻干粉针剂的企业通过了欧盟或FDA认证，冻干机具有在线灭菌功能，并且批与批之间进行灭菌，这是一项最基本的要求。中国GMP（2010版）与欧盟GMP的要求已基本一致，强调的都是“质量风险管理”，无庸置疑，对冻干机进行在线灭菌（而不仅仅是消毒）是通过GMP（2010版）认证的最基本条件。
    　　中国药典（2010版）附录——灭菌法：无菌分装及无菌冻干是最常见的无菌生产工艺，相关的设备、包装容器、塞子及其它物品应采用适当的方法进行灭菌，并防止被再次污染。
    　　冻干粉针剂生产过程中从药液的除菌过滤到轧盖完成，药品在生产环境中暴露时间长达30-50小时，其中约30小时都在冻干箱中，为了保证产品的无菌，因此需要把冻干箱（干燥箱、冷肼、相关管道）作为一个无菌空间来管理。
  2. 为何GMP（2010版）对“无菌药品”部份进行大幅度的修改？
    　　从事过无菌药品的同行应该都知道，GMP（1998版）太过落后，企业执行过程中，无菌风险无法控制，国家局不得不提出“万级”与“无菌万级”的概念进行过渡。GMP（2010版）对“无菌药品”进行大幅修订使其内容与欧盟GMP基本一致。
    　　大幅提升要求的主要原因有三：①安全用药的需要：无菌药品的给药方式一般是透过人体自我保护屏障，采用注射或输液的方式直接进入血液或组织，作用迅速，因此药品质量的问题将迅速威胁到病人的生命。②提高竞争的需要：中国加入世贸，参与全球竞争，需要高质量的药品，不少具备实力的企业已率先通过欧盟或FDA认证。③人民用药的需要：国内制药企业小而散，懂药与不懂药的都扎堆于制药业，低水平重复建设，最终导致恶性竞争，产品质量受到影响。近几年国内药害事件频发，国民反响激烈，向国际标准看齐势在必行。抱怨“国际标准，国内价格”已没有任何实质意义。
  3. 国内生产冻干粉针剂的冻干机装配水平如何？
    　　某冻干机制造企业曾对国内生产冻干粉针剂的药企调查统计数据显示：目前国内在用冻干机只有10%配置了在线蒸汽灭菌（SIP）系统。
    　　10%配置SIP装置的冻干机，也没有完全发挥其功用。在生产中也没有做到批与批之间进行灭菌，有的药企一周（或一月）灭菌一次，有的药企甚至将SIP系统成了摆设，仅在GMP认证时展示给认证专家看。主要由于SIP系统自动化程度高，故障率相应较高，灭菌周期长等原因，另外90%的冻干机均未配置SIP系统，在生产中只是采用消毒剂进行处理。其中大部份使用75%酒精，也有采用臭氧甚至甲醛处理的。
  也正是考虑到上述“国情”，才有了前文中“专家们的最后意见”。
  4.为什么大部份药企未采用配置在线灭菌的冻干机？
    　　造成目前局面有下列原因：①国内买不到：由于技术原因，我国在1998年以前基本上生产不出具备SIP功能的冻干机，少数几家财力雄厚的生化药厂只能选择国外冻干机。1998年以后，以东富龙公司为代表的冻干设备生产企业才能生产出具备SIP功能的冻干机。②质量风险意识低：中国药企普遍存在基础较差，质量风险意识较低，在执行GMP时注重“符合性”，且GMP认证检查员考虑到“国情”，让未配置在线灭菌冻干机的企业均通过GMP（1998版）认证。于是药企普遍有这样的认识：“既然只进行冻干箱消毒就能通过GMP认证，说明是“符合GMP要求”的，那又何必花大价钱去购买配置在线灭菌装置的冻干机呢？”。③设备价格高：配置SIP系统的冻干机价格比普通冻干机贵了将近一倍，使用、维护费用也相对提高。④灭菌周期长：一般进行在线蒸汽灭菌周期8-10小时，致使生产周期延长，对于生产量大，产品附加值低的药企，肯定不乐意。
  5.配置SIP系统的冻干机与普通冻干机的差异在哪里？
    　　首先配置SIP系统冻干机的干燥箱体和真空冷凝器属于D类压力容器，其箱体和冷肼在设计和制作上也要比普通冻干机复杂得多，例如：干燥腔室不能使用有机玻璃或普通玻璃观察窗，箱门应使用不锈钢耐压门窗。
  其次在线蒸汽灭菌装置由安全阀、电接点压力表、压力变送器、蒸汽总阀、前箱进水进汽阀、后箱进水进汽阀、前箱排水排汽阀、后箱排水排汽阀、总排阀、间排阀、疏水阀、水环泵、进水阀等部门集成。装置复杂，自动化程度高，系统制造成本高，售价也高。相应地维修护成本也高。
    　　另外由于是D类压力容器，应按“压力容器管理规范”在当地质量技术监督管理部门备案后才能使用，每年应检测维护，交纳相关费用，并且在使用一定期限后应报废处理。
  6.消毒与灭菌有什么不同？

• 生物迷 (2015-3-11 21:22:45)

  消毒与灭菌是两个完全不同的概念。
    　　“消毒”是指用化学性试剂杀灭致病微生物的过程。消毒剂能使致病微生物数量下降，但不能杀灭孢子和所有的微生物。
    　　“灭菌”即用物理或化学手段将物体中活的微生物杀灭或除去，从而使物品中残存活微生物的概率下降至预期的无菌保证水平的过程。最终灭菌的物品微生物存活概率即无菌保证水平（SAL）不得高于10-6。常用的灭菌方法有湿热灭菌法、干热灭菌法、辐射灭菌法、气体灭菌法和过滤除菌法。
  7.冻干机的在线灭菌方法有哪些？
    　　目前冻干机的在线灭菌方法有蒸汽灭菌、环氧乙烷灭菌、气化双氧水灭菌(VHP)等方法。其作用均为对干燥箱、真空冷凝器、相关管道的内表面灭菌，创造一个适于药品生产的无菌环境，避免冷冻干燥过程中对药品造成微生物污染的风险。上述三种方法均为药典推荐的灭菌方法，其中环氧乙烷由于高压、易燃、易爆、有毒，已基本不在冻干机中应用。
    　　蒸汽灭菌、气化双氧水灭菌（VHP）都能确保最终灭菌的物品微生物存活概率即无菌保证水平（SAL）不高于10-6。
  8.冻干机采用蒸汽灭菌的优缺点是什么？
    　　目前上市的冻干机普遍配置有SIP系统，采用纯蒸汽灭菌。其优缺点：① 蒸汽灭菌法是各国药典、GMP、消毒灭菌技术规范推荐的方法， FDA确认过程没有任何疑义的灭菌方法。重现性好，无污染，可用生物指示剂验证。②蒸汽灭菌使腔室内有很大的压差变化，长期反复的受压、抽真空，缩短设备寿命，同时可能会产生干燥箱、冷凝器的密封件部位的泄漏，而影响冻干制品的质量。③干燥腔室内部构件一般由不锈钢材料制造，应避免蒸汽灭菌对不锈钢构件的腐蚀、干燥箱内表面生锈，生锈大多数情况下由高温腐蚀所引起，其主要机理是氯离子对不锈钢材料的晶间腐蚀，特别是含有氯化物溶液的高温、高压、湿热环境对不锈钢表面钝化膜的破坏非常大，而不锈钢的耐腐蚀性主要依靠这层微薄的钝化膜，因此干燥箱体不锈钢应采用316L超低碳钢，该钢具有较强抗晶间腐蚀通能力。④蒸汽灭菌周期8-10小时，消毒周期长。
  9.冻干机采用环氧乙烷灭菌的优缺点是什么？
    　　在SIP系统还不成熟时，有些冻干机采用环氧乙烷灭菌，但目前已基本淘汰不用。其优缺点：① 环氧乙烷灭菌法是各国药典、GMP、消毒灭菌技术规范推荐的方法，可用生物指示剂验证。②环氧乙烷有毒，灭菌过程中，应注意残余废气中环氧乙烷的含量是否符合药品生产卫生要求。人员应注意保护，吸入过量可引直头痛、恶心、呕吐，严重者可引起水肿。环氧乙烷是易燃易爆物质，明火可引起燃烧，同时由于气体分解还可能引起爆炸，因此使用环氧乙烷应特别注意安全。③采用环氧乙烷灭菌时，一般在高压腔室内进行。灭菌柜内的温度、湿度、灭菌气体浓度、灭菌时间是影响灭菌效果的重要因素。药典推荐的灭菌条件：温度54℃±10℃，相对湿度60%±10%，灭菌压力8*105pa，灭菌时间90min。④灭菌效果随外界环境条件、腔体内微小水滴会出现较大的差异；较难彻底地清除冻干机内残留物。⑤环氧乙烷会对冻干机有腐蚀作用，对箱门密封条、真空隔离密封条、传感器导线的绝缘层、箱体产生腐蚀作用。⑥环氧乙烷灭菌周期为12-18小时，较蒸汽灭菌周期更长。
  10.冻干机采用汽化过氧化氢灭菌的优缺点是什么？
    　　汽化过氧化氢（VHP）灭菌方法是美国灭菌公司（American sterlizger co,简称AMS CO）研究发明的，在医疗器械、生物培养箱、生物安全柜、冻干机的灭菌已非常普遍，工艺已经非常成熟。其优缺点：①汽化过氧化氢灭菌法是各国药典、GMP、消毒灭菌技术规范推荐的方法，灭菌工艺重复性好，可用生物指示剂验证。②安全性高：该方法灭菌过程在常温、常压下运行，冻干机的干燥箱、冷肼无需按D类压力容器设计。③运行费用低：该方法每个灭菌循环双氧水耗用量极少，以15m2冻干机为例，每批运行成本汽化过氧化氢方式是纯蒸汽方式的10%。④配套费用低：采用汽化过氧化氢灭菌的冻干机的初装费用低于蒸汽灭菌冻干机30-50万。如果采用可移动式VHP发生器，可以对多台冻干机配套灭菌，则设备费用将成倍下降。无需纯蒸汽系统的长期配置，无需纯蒸汽的长期供应。⑤灭菌周期短：如果纯蒸汽消毒周期为8-10hr，环氧乙烷灭菌周期为12-18小时，则气化双氧水灭菌周期只有5-7hr。⑥无害无污染：由于气化过氧化氢灭菌的最终残余物为水和氧气，没有环氧乙烷、甲醛等的毒性和致癌作用，因此对环境、操作人员无害。⑦对设备无损害：蒸汽灭菌使灭菌腔室内有很大的压差变化，经常处于受压→真空状态，湿热气体易破坏冻干机腔体内表面不锈钢的钝化膜，缩短设备寿命。汽化过氧化氢灭菌由于压力、温度条件的改善，使冻干机的运行寿命和维修周期延长。⑧汽化过氧化氢灭菌要求所有灭菌表面必须干燥，各区域温度保持均衡。否则灭菌效果腔体内微小水滴或冰渣会出现较大的差异。
  11.现用的冻干机未配置在线灭菌装置怎么办？
    　　建议您依据公司具体情况在下列方案中选择一种：
  ①汰旧更新：目前国内药企有90%冻干机无SIP功能，不少厂家已迅速行动，纷纷汰旧更新，能生产SIP的药机厂生意红火。如果您公司效益特别好，冻干机已使用多年，故障率高，不如淘汰旧机，订购新机，现在国内已有多家药机厂均可生产配置SIP的冻干机，技术已经比较成熟，10m2配SIP系统的冻干机大约300万左右。
  ②加装SIP：如果您出于多方面考虑不想淘汰旧冻干机，且旧冻干机是按压力容器制造，可将冻干机加装在线纯蒸汽灭菌系统。
  ③加装VHP：如果您不想淘汰旧冻干机，且旧冻干机又不是按压力容器制造，建议加装气化过氧化氢（VHP）在线灭菌装置，同样能达到对冻干机在线灭菌，无菌保证水平SAL≤10-6。选择加装VHP将有“适当改造”与“零改造”两种方案可选，具体在后面详述。
  12.将冻干机加装在线蒸汽灭菌系统（SIP）需要确认的工作有哪些？
    　　将冻干机加装在线纯蒸汽灭菌系统是冻干机改造的首选方法，也是公认无异议的冻干机灭菌方法。但改造前须确认下列条件是否达到：①该冻干机制造时是按压力容器设计的，并有压力容器设计检测证书和备案证书。②该冻干机的换热系统（即导热油循环系统的所有装置）必须是按使用硅油作为导热油设计。③纯蒸汽系统供应能保证。
    　　如果上述条件能达到，那么该机可以通过加装SIP系统达到GMP要求。您最好与该机原生产厂家（有压力容器设计制造资格证）联系进行改造，每台冻干机的改造费用一般为100万元左右，时间一般为2个月左右。如果想联系原厂家以外的其它厂家，应特别注意是否有压力容器证书、自动控制系统的兼容性。
    　　如果上述条件的任意一项达不到，则您千万不能善自加装SIP系统。原因是：①配置SIP系统冻干机的干燥箱体和真空冷凝器属于D类压力容器，其箱体和冷肼在设计和制作上也要比普通冻干机复杂得多。自行将普通设备改造成压力容器，违法《压力容器管理条例》，是违法行为，一旦出事故会追究法律责任的，广东已有在蒸汽灭菌过程发生爆炸致人伤亡、洁净厂房垮塌的血的教训。②配置SIP系统的冻干机在设计制造时是使用硅油作导热油的，而普通冻干箱是采用4-4-2三元混合液或其它液体作导热油，二种导热油的沸点、凝固点、导热系数、运动粘度、比热、导热系数、密度、传热效率不一样，因此换热器面积、板层面积、循环泵等配置均不一样，如果仅仅只是更换导热油，可能出现冻干曲线难以控制、冻干失败或生产周期延长等情况。③冻干机进行纯蒸汽灭菌时消耗的蒸汽量较大（具体数量可参照蒸汽灭菌柜折算），在脉动及升温阶段，纯蒸汽供应得到保证，否则将进一步延长灭菌周期，并打乱原用汽计划或生产计划。

• 生物迷 (2015-3-11 21:23:06)

  13.将冻干机加装过氧化氢（VHP）在线灭菌装置需要确认的工作有哪些？
    　　将冻干机加装VHP（气化过氧化氢）在线灭菌系统，设备在常温、常压下进行灭菌，使用与高压蒸汽灭菌锅相同的生物指示剂（嗜热脂肪芽孢杆菌孢子）进行验证同样达到6-log的杀灭率。
    　　您选择的供应商不同或VHP设备工作原理不同，则改造方案也不一样。目前市面上大体有两类VHP设备可供选择。
    　　一类以进口VHP设备为代表，如美国STERIS公司、英国Bioquell公司、法国LA CALHENE均有产品有中国销售，国内高得泰林公司也以研发成功。但均为生物安全柜、隔离器、无菌室的灭菌而设计制造，由于设计时未考虑冻干机结构特点，将其应用于冻干机时遇到如下三个问题：①设备改造的问题：目前市面上的VHP需要提供进、出两个专用接口，而一般情况下冻干机上很少有多余的接口。如果重新开孔，将面对箱体应力、保温层、接口钝化、真空泄漏等一列问题。②浓度均一性问题：由于过氧化氢蒸汽在常温常压下扩散速度慢，而冻干机内有层板、冷凝管等许多构件，阻碍了过氧化氢扩散，而这些因素在设计时未考虑进去，因此浓度的均一性是一个很大的挑战。③费用问题：目前市面上进口VHP报价70万元左右，阻碍了制药企业应用的积极性。
    　　该类VHP设备需冻干机提供进气、出气两个专用接口，与VHP设备连接形成一个循环系统。因此选择这类设备前，应确认下列因素：①要确认冻干机是否具备这样的专用接口，否则应在冻干机前箱、后箱开孔并加装接口。因为在冻干机上自行开口会涉及下列问题：保温层的破坏、冻干机箱应力的改变、焊接点的重新钝化、真空泄漏率变化等一系列问题。②由于这类VHP设备并非为冻干机专门设计，而气态过氧化氢扩散速度较慢，因此使用中无法迴避冻干机内数量众多、形态各异的层板、冷凝盘管等构件对气态过氧化氢扩散的影响，特别是与（如清洗用喷淋球及管道、真空管道、排水管道、进气或渗气管道等），气化过氧化氢无法到达。致使冻干机内各处过氧化氢浓度不一，最终可能导致灭菌失败。
    　　还有一个VHP设备厂家是温州维科生物公司自主研制的产品，其中一种VHP能满足生物安全柜、隔离器、无菌室的灭菌，这里不再过多阐述，另一种是为冻干机灭菌专门设计制造的VHP设备。
    　　该设备的最大的特点是：
  ①国内唯一：该机是目前国内唯一专门为冻干机灭菌设计的VHP设备。在设计时充分考虑并有效解决了冻干机内层板、冷凝管、各种连接管道等许多构件对气化过氧化氢扩散的影响，使冻干箱、冷肼、连接管道各处的浓度趋于一致。
  ②冻干机零改造：不用对现有冻干机进行任何改造（即冻干机零改造），可依据冻干机的大小选择合适的VHP设备型号，设备购回后即可直接应用或验证合格应用。
  ③价格合理：根据空间大小。拟定设备参数。该设备价格只有国外VHP设备的1/2-1/3。且移动方便，如果冻干车间有一台以上冻干机，可以共用一台VHP设备，这样设备配置费用成倍下降。
  ④验证服务：该设备操作简单，岗位员工容易掌握，可以提供操作及验证培训。
  该机型已经在市场上得到了认可
    　　对于已经配置SIP系统的冻干机也可以再配置一台VIP灭菌设备，两种灭菌系统交替使用，从面缩短灭菌周期，降低运行费用，延长冻干机的使用寿命。
    　　国内冷冻干燥制药方面的权威人士钱应璞（国家食品药品监督管理局认证中心客座教授、中国制药协会理事等）在其专著《冷冻干燥制药工程与技术》中对VHP灭菌进行了比较详细的介绍，并推荐使用。详细内容可参阅其专著。
  14.冻干机使用蒸汽灭菌或VHP灭菌如何验证？
    　　中国药典（2010版）附录—灭菌法：使用纯蒸汽和VHP灭菌工艺均采用生物指示剂进行验证。气化过氧化氢（VHP）最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子（如NCTC10007、NCIMB8175、ATCC7953），每片活孢子数1*106-5*106个。
    　　目前国内许多公司均有生物指示剂销售，尽量使用进口生物指示剂，确保验证的可信度。
  15. 既然VHP灭菌有如此多优点，为何在冻干机中没有得到普遍应用呢？
    　　采用热湿蒸汽灭菌被公认为是有效和可靠的，目前配置SIP系统的冻干机已经成熟，且价格较高，能给生产商带来更大的利润。而且开发VHP灭菌的冻干机需要投入经费，对于习惯了仿制为主的国内药机厂家肯定不乐意为之。
  16.为何不推荐臭氧用于冻干机灭菌？
    　　近年来臭氧用于洁净室的消毒已经很普遍，也有臭氧机生产企业推荐将臭氧用于冻干机灭菌，但未见有成功的报道。本人不推荐的原因如下：①中国药典（2010版）将臭氧列为气体灭菌方法之一，但未指明验证用生物指示剂，目前市面上未见臭氧用的生物指示剂出售。不能用法规方法进行验证的工艺当然不能采用。②目前上市的臭氧机的工作原理注定臭氧在冻干机内浓度及分布的均匀性不好。③许多报道认为：臭氧对各种微生物的杀灭效果不一，对霉菌的杀灭效果比对杂菌的效果好，臭氧在低浓度下对细菌的杀灭作用不大，因为细菌在低浓度臭氧作用下暴露一定时间，会产生抗体。在较高浓度时，对橡胶、塑料等高分子材料。④一些企业进行了将臭氧应用于工衣、铝塑盖灭菌的试验，从无菌培养的情况来看，臭氧只能起到消毒作用，根本不能达到灭菌效果。⑤用空气作原料来生产臭氧时，会产生少量的氮氧化合物，对冻干机有较大腐蚀性。

• 生物迷 (2015-3-11 21:23:45)

  无菌原料药生产中无菌工艺验证探讨

  
  
  无菌生产工艺是无菌原料药制备过程中难度最大的工艺验证之一，由于许多原料药无法最终灭菌，原料药在进行过滤、干燥、粉碎、分装等操作过程中就必须尽可能地避免被微生物污染。影响产品是否无菌的因素相当多，如生产的设计及其设备布局、生产环境状况、所有与生产相关的设备及物料的污染状况、人员操作和卫生状况等，每一个环节对最终产品的质量都举足轻重。为了确保无菌生产工艺系统无菌的可靠性和适应性，将需要通过一系列的验证来确保产品的无菌性。
  无菌工艺验证需要解决很多问题，如模拟介质的选择、无菌工艺验证的相关要求、设备的灭菌、如何达到全培养的目的、达到无菌的组织保证以及最终结果分析等，任何一项问题没有处理好，都会对最终结果造成影响。
  1模拟介质的选择
  无菌原料药对模拟介质的选择很关键，选择的模拟介质应有如下特征：
  (1) 没有抑菌作用。若模拟介质有抑菌作用，将会对生产系统中的细菌生长产生抑制作用，以至于不能培养出细菌，产生假的结果。模拟介质最好具有促进细菌生长的作用。如果选择对细菌生长有促进作用的固体培养介质做验证，对生产环境的保护则特别重要。因为，如果有些操作是使介质暴露的，介质的尘粒会飘散到某些较难清洗的地方，如空调系统的送风口和回风口附近，给细菌在该处的滋生创造了条件，所以应有措施保护不易清洗的死角不被介质污染。
  (2)模拟介质还应有较好的溶解度。因为若溶解性能不好，悬浮在培养基中的模拟介质使培养基发生混浊，影响结果的判断。
  (3)模拟介质加入培养基后，不应影响培养基的质量，pH不发生大的变化，以适应大多数细菌的生长。
  (4)对设备没有腐蚀性，对人体无害，对环境不发生污染。
  选择模拟介质，需要根据各公司的具体情况而定，目前多数厂家采用培养基灌装试验来证明其无菌工艺的可靠性。所用的培养基应有较好的溶解性，营养程度要高，能够满足多种微生物的生长。一般通过生长促进试验验证。如生产工艺是在厌氧条件下，选用的培养基应能够使厌氧微生物生长。
  2无菌工艺验证的相关要求
  2.1验证前的准备
  2.1.1生产设施的设计和确认
  生产设施的设计应能使潜在的污染降低到最小。例如，生产设施应易于清洁和消毒、产品或物料敞开之处的空气要有一定的质量要求、温度和湿度的控制要适宜、穿着无菌衣的操作人员感到舒适、能防止污染和交叉污染等等。应重视设计上的细节，减少污染源，以确保无菌生产得以实施。无菌工艺验证是执行难度较大的验证之一，参与者应充分意识到设施的设计和确认，其是验证成功的主要因素。
  2.1.2公用工程的确认
  影响产品质量的公用工程(如蒸汽、压缩空气、加热、制冷、水系统等)都应经过确认。公用工程是生产得以正常实施的保证之一，若其中任何一个系统出现故障，将会使产品发生潜在的或严重的污染。应有公用工程的维护计划并按计划执行，目的就是不让系统发生故障，保证生产的顺利进行，而不是发生故障后去修理，经常发生故障而被维修的公用工程是不能保证无菌生产的。
  2.1.3设备和工艺确认
  验证实施之前，所有的设备、无菌环境、计算机控制系统以及生产工艺都应经过验证。产品暴露是发生污染使无菌工艺验证失败的主要原因之一，为防止或降低污染发生的几率，给暴露产品提供层流空气的百级层流罩或隔离器是非常重要的，同样被灭菌过的物品由灭菌器到生产线的传递和经由必要的手工操作进入生产线前的保护也是至关重要的，应尽量避免人员对设备或物料接触的操作。这些都应经过验证。
  2.1.4设备的清洗和灭菌
  在无菌工艺验证之前接触模拟介质的设备表面应清洗灭菌，并防止灭菌后的再污染。若生产的药品具有抗菌性或者杀菌性，这种清洗尤为重要，要确认清洗后对微生物没有抑菌性，或可以有效的消除抑菌性。若清洗或灭菌不彻底，残存的药品会使模拟介质受到污染或设备表面的微生物使模拟介质染菌而使验证失败。这种清洗和灭菌过程应经过验证，以保证清洗彻底和灭菌成功。
  设备灭菌是无菌工艺验证的关键的一环，所有与工艺相关的设备都必须灭菌，首先设备的灭菌要通过灭菌验证，包括最冷点的确定、温度分布和热穿透、生物指示剂的挑战，最终确定灭菌的温度、时间和排气点。所用的生物指示剂应确认其类型、来源、菌种的浓度和D值。

• 生物迷 (2015-3-11 21:24:10)

  3无菌工艺验证的组织保障
  为了保证无菌工艺验证的顺利执行，成立无菌工艺验证执行小组，目的是：(1)为验证工作提供人、财、物支持;(2)最终决定验证期间发生各种事务的处理;(3)批准验证方案和计划及验证报告;(4)分别负责各子小组的工作。
  无菌工艺验证执行团队分组如表1所示。
  表1无菌工艺验证执行团队分组
  序号 组别 序号 组别
  1 验证流程实现组 9 设备试压、泄漏测试及公用支持系统保证
  2 现场环境、人员卫生检查组 10 摄像及现场记录组
  3 设备灭菌效果确认保证组 11 设备清洗效果保证组
  4 过滤器完整性检查组 12 操作现场指导
  5 各种物品包括培养基物料准备 13 样品培养组
  6 验证时间节点的控制 14 洁净区内设施无菌性保证组
  7 仪表准确性保证组 15 后勤保障组
  8 环境监控、现场取样 16 安全保障组
  要求：各组的检查情况均需要进行书面确认并将记录留档;各组及全体人员发现异常情况均需要及时上报;全体组长在验证期间全程值班。
  4无菌工艺验证的过程
  无菌工艺验证的设计，应充分体现QbD(质量源于设计)的理念，尽可能地与工艺过程符合，最大限度地保证产品的质量。
  4.1标准操作规程的确认以及人员培训
  标准操作规程(SOP)是指导操作人员进行某项操作的书面程序，是操作人员的操作标准，是生产操作成功的关键。标准操作规程应能对操作人员提供足够的指导以完成本项操作。
  标准操作规程应由技术人员编写，部门主管审阅，质量保证部主管批准。将批准后的标准操作规程对操作人员进行培训，使之真正理解并能熟练掌握。标准操作规程的原件及培训记录存放在资料管理部门，操作现场存放的是复印件。验证前应确认每一项操作有标准可依，以免造成管理上的漏洞，且确认这项操作已被培训过，同时操作人员已能熟练掌握。
  验证之前应对所有的操作人员和质量管理人员培训与验证有关的各项操作(可根据验证方案和SOP)，以避免验证过程中有关人员不理解甚至不知道怎么做，保证验证的顺利实施。如果生产车间新增加或调换的无菌操作人员超过20%，应重新做无菌工艺验证，以保证无菌操作能顺利进行。
  4.2仪表校正
  仪表校正应由有资格的人员或单位按照公司批准过的SOP来进行，并符合国家可追踪的标准。仪表的校正频率至少符合国家规定，并根据使用频率调整并严于此标准。使用频率越高，仪表的磨损越厉害，校正频率就应越高。由于使用没有经过校正的仪表，所得的数据无效。
  4.3工艺条件
  无菌原料药的生产工艺具有其自己的特点：设备种类多、设备复杂、管路长，且不同的生产工艺有不同的特点，根据各自的特点选择固体或液体模拟介质。虽然，已尽量地减少设备的内部暴露和减少物料产品的暴露，但是不可避免地会有一些设备与外界环境相通，或是物料暴露在环境中，这些开口处应有呼吸器或百级层流空气的保护，更好的是使用隔离器保护。验证时，应有模拟这些物料暴露的操作。
  有些生产工艺中具有结晶的操作，这使得模拟过程有些困难，因为结晶过程中有相变产生，应该考虑这种变化是否会影响到微生物的生长。最好的办法是选择两种模拟介质，它们在结晶过程发生反应生成另一种模拟介质。选择这样的介质可能会有很大困难，简单起见，也可用同一种液体模拟介质模拟结晶过程流经所有管路加到结晶罐中。若结晶过程有加晶种的操作，模拟过程中也应有这样的操作。晶种可用模拟介质代替。为使晶体粒度均匀，有些结晶过程有降温过程，在模拟过程中不应降温，因为微生物在低温下不易生长。
  干燥过程中的温度一般会抑制微生物生长，甚至将微生物杀死，在模拟过程中应保持室温，以免温度太高杀死细菌而使验证失败。也有用冷冻干燥除去湿分的，模拟冻干参数的选择也不应使细菌的生长受到抑制。
  总之，在验证过程中尽量使工艺参数和实际情况一致，但是为了使微生物生长良好，允许选择的工艺参数和实际情况不一致，但是这些参数不应和生产工艺产生重大差别。无菌原料药的分装剂量一般较大，在这种情况下分装过程中应减慢分装速度，以增加产品暴露的可能，在最差状况进行操作。
  在进行验证时，应根据生产过程中曾经出现的异常情况或者可以预想的可能的异常情况设置最差条件，以考察生产过程中出现此异常情况时产品的无菌性质是否会受到影响。

• 生物迷 (2015-3-11 21:24:38)

  4.4操作时限
  在原料药的生产中，每一操作都应有操作时限来保证已灭菌的物品避免受到微生物的污染或产品降解。操作时限越长，产品受污染的几率越大。
  在无菌工艺验证时，应将操作时限调整至最大，在最差状况下操作，如果这时验证结果可靠，那么在小于此时间下进行的操作当然也是可靠的。尤其是已灭菌物品由灭菌到使用时的保存时间更加重要。在验证时，应将已灭菌物品至少放置到规定的保存时间，这样的验证结果更具说服力。每一步操作都应延长甚至超过操作时限，这样会使得总的工艺时间很长，但是这样的验证结果更能保证正常生产时的无菌状态。
  4.5环境监测
  在验证过程中环境的质量至关重要，应在恶劣的环境下进行操作，但是不能恶劣到使产品发生染菌的程度。一般采用增加操作人员数量的办法恶化环境。应对环境进行监测以评价验证过程，所有暴露产品的操作都应同时监测本区域的环境。环境监测包括以下几个项目：无菌室的温度、湿度、尘埃粒子、沉降菌、浮游菌、人员和表面微生物。
  沉降菌和浮游菌用培养皿进行测试，培养基为营养琼脂或其他适宜的培养基。培养皿应放置在微生物监测史上情况最差的部位。在验证过程中应增加取样的频率，并且应在分装区域放有2个以上的取样培养皿连续暴露取样，暴露时间应为分装的全过程，但不宜超过4h，否则营养琼脂变干而不能提供足够的营养使细菌不能长出。若工艺时间超出4h，应重新放置一个新的培养皿进行监测。营养琼脂在使用前应做微生物生长促进试验，以保证营养琼脂对微生物生长的适应性。
  方法如下：选择合适数量的营养琼脂培养基(此数量具有统计学意义)，分别接种10-100CFU 的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、黑曲霉(Aspergillusniger)和环境中的检出菌。细菌分别置于(32.5±2.5)℃的环境中培养不超过3天，真菌置于(22.5±2.5)℃的环境中，分别培养不超过5天。接种的微生物生长良好。测试浮游菌可以用缝隙—琼脂撞击采样法、离心采样法、液体撞击采样法及膜过滤法。一般说来，浮游菌比沉降菌更能反映环境的质量。表面微生物的测试可用擦拭法或Rodac碟。擦拭法用于非规则表面的微生物测试，用擦拭法测表面微生物之前应先测回收率。影响回收率的因素很多，包括微生物的种类和数量，不同的操作人员进行测试会得到不同的回收率，主要原因是擦拭时用力的大小，每个测试操作人员有自己的回收率数值。测试回收率时，不要选择生命脆弱的微生物，因为这些微生物被擦拭时会死去，产生不可信的结果。用Rodac碟测试规则表面的微生物污染程度比较方便，但是这种测试会有营养物质残留在被测试的表面，应清洗干净，否则这是一个很大的污染。尘埃粒子尽可能使用在线监测，取样点数和取样量符合现行的法规的要求，监测的结果应能证明在产品暴露的关键区域空气质量达到了100级洁净区的空气质量标准。
  4.6工艺过程的模拟和全培养
  由于一般原料药生产工艺都经过结晶过程，其间会发生相变，因此无菌工艺验证不可能完全按照原来的实际工艺来进行模拟。
  从原材料配制起，以培养基作为模拟介质，经过除菌过滤、结晶、过滤、洗涤几个步骤后，为了保证所用的介质是全部用于无菌检验，需要对多余的模拟介质采取措施进行全量培养，以保证所用介质的完整性。以后的干燥、粉碎、分装步骤再按生产工艺进行。为了考察各步骤的无菌状况，要在各个阶段进行取样，模拟生产过程中的取样，不要刻意地增加取样点。取样的样品也要进行培养，以达到全面培养的目的。为了保证取样的无菌性，对取样口进行灭菌，如果不能使用蒸汽灭菌，可以使用杀孢子剂灭菌，但在取样前要保证杀孢子剂残留没有抑菌性。
  生产过程中可能有升温、降温过程，此时应注意模拟介质对温度的敏感性。可通过实验室考察。

• 生物迷 (2015-3-11 21:25:16)

  4.7样品培养
  阴性对照：在验证过程中，随机取出有代表性的一定数量的装有培养基的包装容器作为阴性对照。
  阳性对照：验证过程中，随机取出有代表性的一定数量的装有模拟介质的包装容器，1/3接种浓度为<100CFU的5种标准菌株和环境的检出菌，接种后细菌在(32.5±2.5)℃环境下培养48～72h，霉菌和酵母菌在(22.5±2.5)℃培养5天，接种包装容器中均有明显的所接种微生物的生长，以此作为阳性对照。
  样品培养：将分装得到的产品在操作现场灌装培养基，然后密封，检查密封性。全部产品应在(22.5±2.5)℃和(32.5±2.5)℃分别培养7天，总培养14天，每天检查全部样品的微生物生长情况。若发现污染应注明批号、包装容器号，同时检查密封情况。若有破损注明原因。污染的样品应做微生物鉴别，鉴别到种。
  5结果评价及再验证
  在制剂中填充低于5000单元接受标准为0污染，但是在无菌原料药生产中，包装单位较大，得到的总分装容器数一般较小，这使得抽样测试和结果计算失去统计学意义，又因为生产批量是固定的，因此所有产品都应被培养，并且所有的阴性对照和阳性对照都必须合格。若阴性对照或阳性对照不合格，则无菌工艺验证失败需要重新做。若发现有一个容器长菌，就认为无菌生产工艺中有染菌的因素存在，应立即停产，调查产生污染的原因，采取措施后重新做验证。
  新生产线在投产之前要做无菌工艺验证，验证通过后该生产线才能投入使用。正在运行的生产线应每年做2次无菌工艺验证，每个可能进入洁净区或与生产接触的人员每年至少参加一次无菌工艺验证。对于厂房经过大修、主要设备更换以及新建厂房等情况应进行至少连续3个周期的无菌工艺验证。如果是周期性的再验证，如果在该两次验证期间没有发生产品的染菌，可进行一个运行周期的验证就足够了;如果该验证通过，则证明该系统能够稳定地保持无菌性;如果该验证失败，应该详细地调查原因并消除隐患后，再重新进行至少连续3个周期的验证，只有所有验证全部通过，才能认为本无菌生产工艺是可靠的。
  如果在两次验证期间发生过产品染菌情况，经过调查和细菌鉴别，确定染菌原因是由可以控制的因素造成，或染菌因素比较轻微，改正这些失误后可以继续进行生产;如果进行调查及细菌鉴别不能确认染菌原因，则应对无菌生产系统进行无菌工艺验证以确认哪些环节造成系统染菌，并对这期间生产的产品进行无菌风险的调查和评估。
  6验证报告
  验证完成之后应起草一份验证报告，对以上内容做一个简要总结，主要包括以下内容：验证题目、验证目的、参加验证部门和人员、人员的培训、采用的工艺参数和操作时限、选择的模拟介质和培养基、模拟过程中的中断、偏差及其调查、培养条件和最终结果，最终报告应由企业质量负责人批准。只有当最终结果合格并且最终报告经过批准后，企业的无菌原料药生产才能开始(或继续)进行。

• 生物迷 (2015-3-11 21:27:13)

  臭氧灭菌在药品生产环境中的应用

  
  
  药品生产环境讲的就是指药品生产要求的洁净室的环境。洁净室空气洁净度要求必须使尘埃粒子和微生物最大允许菌落符合相应级别的标准。
  洁净室的环境要求，给我们设计、生产、管理提出了必不可少的一个问题，
  就是室内空气灭菌。
  1传统的灭菌方法：
  传统的灭菌方法主要有三种，一是紫外线灭菌，二是试剂灭菌，三是加热灭菌。这些方法长期以来已被人们习惯使用，其安全性和可靠性早被实践所确认。
  科学在不断发展和更新，到90年代后期臭氧灭菌已进入药品生产中应用。那么传统的灭菌方法和臭氧相较而言，传统灭菌方法有各自的不足。
  紫外线灭菌的主要问题在于它穿透能力小，易造成死角，在紫外线照射不到的地方，消毒效果不好，其杀菌能力随着使用时间的增加而减小。而且，灯管寿命短，更换过于频繁，运行费用高，灯架自身难以清洁。
  化学试剂灭菌，典型的如甲醛熏蒸，操作麻烦，熏蒸时间长，有二次残留污染物，对人体有害。做一次甲醛熏蒸至少需要8小时以上。在消毒后的几天内，其悬浮粒子数会增加。
  加热消毒包括干热和湿热，其缺点是温度高，能耗大，有的物品如某些原材料、仪器仪表、塑料制品等就不宜加热。
  近年来科学家和医药行业经过研究、设计、生产、应用，臭氧灭菌已经得到了认识和确认。特别是在近几年的GMP认证的技术改造和医药工程项目中已被广泛应用。
  2 臭氧的消毒原理
  臭氧在常温常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧气和单个氧原子，后者具有很强的活性，对细菌有极强的氧化作用，臭氧氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏其细胞膜，将它杀死，多余的氧原子则会自行重新结合成为普通氧分子，不存在任何有毒残留物，故称无污染消毒剂，它不但对各种细菌（包括肝炎病毒，大肠杆菌，绿浓杆菌及杂菌等）有极强的杀灭能力，而且对杀死霉菌也很有效。
  我国卫生部颁布的“消毒技术规范”中，对臭氧的杀菌作用，使用范围及使用方法都有明确的规定。肯定了臭氧是一种广谱杀菌剂，可杀灭细菌繁殖体和芽胞、病毒、真菌等，可破坏肉毒杆菌毒素。臭氧的杀菌速度较氯快。
  3 臭氧灭菌在药品生产环境中的应用
  臭氧灭菌早被科学家研究，国家有关行业做过肯定和推荐应用，但臭氧灭菌在药品生产环境中的应用才是近几年逐渐被广泛使用。
  经过实践应用和总结在制药行业应用广泛的有以下几个方面：
  3.1洁净区的消毒灭菌
  在制药厂洁净区面积较大，几乎都有中央空调净化系统完成对各洁净区的净化消毒。传统的消毒方法是用甲醛熏蒸，如上所说，甲醛熏蒸的弊病不少。用臭氧灭菌来代替是最简便易行的好方法。其方法极为简单，根据洁净厂房空间的大小取选标准定型的臭氧发生器。然后将臭氧发生器直接放到空调净化系统的风道中，称为内置式臭氧发生器。臭氧随着风道的气流送入各洁净区，对洁净区进行空间消毒灭菌，剩余臭氧吸入风口，由中央空调带走。也可以将臭氧发生器放置在空调机组中，将臭氧打入中央空调的风道中，然后被送到各洁净室，称为外置式臭氧发生器。外置式臭氧发生器安装检修方便，但制造成本要高一点。两种方法消毒效果是一样的。按照卫生部消毒规范，对空气消毒的臭氧浓度是5ppm,但事实上洁净区消毒不仅是对空气的消毒，实际上还包括了设备、器具等物体表面的消毒，所以一般设计浓度为10 ppm，相当于每立方米空气中臭氧含量20毫克。每天上班前开机两小时，上班时关机，就可以保证一天内洁净区的浮游菌和沉降菌达到GMP的要求。
  我公司粉针剂、水针剂、固体制剂所属五套中央空调系统均采用了洁净室臭氧灭菌。效果很好，经过了国家食品药品监督局GMP认证。几年运行一直良好。
  3.2空间的消毒
  对于有些制药生产工序当没有中央空调或者不需设中央空调，但房间内需要单独灭菌处理。方法是根据房间空间大小选取一定浓度的臭氧发生器，直接安装在房间内。根据需要设定消毒时间，消毒结束便自动关机，所以使用非常方便。
  对于有洁净度要求的房间，机内装有过滤器，使臭氧发生器具有自洁功能，以达到消毒和洁净的目的。
  3.3器具的表面消毒
      在药品的生产过程中，常常要对原材料、工器具等进行表面消毒，利用臭氧发生器消毒简便易行，且消毒效果很好。
  我公司水针剂生产中，周转盘经过清洗后传入灌封室之前要进行消毒，这样我们在清洗完后的周转盘存放室选择安装了臭氧发生器，待周转盘清洗完毕放置好后，打开并设置好臭氧发生器，到时间后自动关闭。效果很好。
  总之，臭氧消毒到目前已在全国制药行业被广泛应用。臭氧发生器无论从产品到应用技术方面均得到了很大的提高和发展。在选用时着重要考虑自己的实际情况和适合特点，同时也要考虑其半衰性和衰退性以及投入与经济效益的关系。以便臭氧在药品行业得到更好的应用。

• 生物迷 (2015-3-11 21:28:39)

  臭氧杀菌无残留

  
  
  本文全面分析和介绍了水电解臭氧杀菌的机理和方法，并确保使用时纯化水或高纯水中无臭氧残留，为制药用水系统杀菌提供了一个很好的选择。
  臭氧是一种广谱杀菌剂，通过氧化作用破坏微生物膜的结构而实现杀菌效果，可有效杀灭细菌繁殖体、芽孢、病毒和真菌等，并可破坏肉毒杆菌毒素。臭氧灭活病毒机理是：首先作用于细胞膜，使膜构成成份受损伤而导致新陈代谢障碍，臭氧继续渗透穿透膜并破坏膜内脂蛋白和脂多糖，改变细胞的通透性，通过氧化作用破坏其核糖核酸RNA或脱氧核糖核酸DNA物质，从而导致细胞溶解、死亡。
  臭氧的半衰期仅为30~60min，高浓度臭氧水的杀菌速度极快，100ppb臭氧浓度在1min内能杀死60?000个微生物。研究表明，水中臭氧浓度超过8ppb时，微生物即停止繁殖（图1），水中臭氧浓度超过50ppb时，系统能有效杀菌微生物和细菌，ISPE建议水中臭氧浓度控制在20~200 ppb。臭氧能刺激人的呼吸系统，造成呼吸系统的应激性反应，严重时会造成可逆性伤害。臭氧的毒性主要表现在其强氧化能力，臭氧浓度在20ppb时，嗅觉灵敏的人便可觉察，称为感觉临界值，浓度在150ppb时为嗅觉临界值，一般人都能嗅出，当浓度达到1～10ppm时，称为刺激范围，10ppm以上时为中毒限。

  
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• 生物迷 (2015-3-11 21:29:01)

  臭氧在水系统中的应用
  制药用水储存与分配管网系统会不断滋生微生物，臭氧能有效杀灭水中的微生物并有效降解已经形成的生物膜，臭氧经紫外灯破除后完全无残留，臭氧杀菌法已成为常温制药用水储存与分配管网系统中能连续去除细菌和病毒的最好方法之一。与巴氏消毒相比，臭氧杀菌系统除了具有操作简单、水温无波动、无需工业蒸汽、消毒时间短和降解生物膜等优势外，管道材质选择余地也非常大，臭氧杀菌系统为常温运行系统，可采用不锈钢材质或PVDF材质进行建造，选择PVDF材质建造的纯化水臭氧杀菌系统能有效降低系统投资。
  水电解臭氧发生器（图2）是欧美主流的臭氧发生设备，其工作原理为：来自制药用水循环管路的纯化水或高纯水进入反应单元的阳极室，在阳极和电化稳定膜之间的接触表面被分成两种成分，氢质子进入膜并在阴极一侧被压缩为氢气后释放到大气中，而在阳极一侧的自由氧则转化为臭氧，快速溶于水中形成高浓度的臭氧水，并重新回到制药用水储存与分配系统中。水电解臭氧发生器最大的优点是采用待消毒处理的纯化水来产生臭氧，从而有效杜绝了来自系统外部的其他污染。

  
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• 生物迷 (2015-3-11 21:29:33)

  中国GMP、欧盟GMP和美国FDA cGMP要求制药用水的制备、储存和分配系统应当能够防止微生物的滋生。同时，中国药典、欧盟药典和美国药典对制药用水中的微生物含量有着严格的要求，附表为各国药典对原料水微生物限度的详细要求。实践表明，臭氧浓度达到100~200ppb时，能有效保证制药用水储存与分配系统中微生物含量不超过1cfu/100ml。

  
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• 生物迷 (2015-3-11 21:29:56)

  臭氧杀菌原理
  水电解臭氧杀菌法主要分为连续型和间歇型两种。图3为典型的连续型臭氧杀菌原理，整个系统采用3个在线臭氧探头对储罐、管网入口端和管网回水端的臭氧浓度进行实时监测，系统水温控制在20℃左右，呼吸器出口采用活性炭吸附或加热的方式进行臭氧破除。正常生产时，臭氧发生器和紫外灯均处于开启状态，纯化水储存系统始终处于臭氧保护状态，用点管网采用253.7nm波长的紫外灯将臭氧从循环管网系统中完全破除，以保证使用时纯化水中无残留臭氧；周期性杀菌时，将紫外灯关闭，维持水中臭氧浓度并保持一定时间，杀菌即可结束。

  
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• 生物迷 (2015-3-11 21:30:47)

  图4为典型的间歇型臭氧杀菌原理，整个系统采用一个在线臭氧探头对管网回水端的臭氧浓度进行实时监测，系统水温控制在20℃左右。正常生产时，臭氧发生器处于关闭状态；周期性杀菌时，开启臭氧发生器，维持水中臭氧浓度并保持一定时间，杀菌结束后，采用253.7nm波长的紫外灯将臭氧从循环管网系统中完全破除，以保证使用时纯化水中无残留臭氧。
  制药用水分配系统推荐采用专业的三维设计软件进行框架模块化设计并指导组装。模块化设计主要有按图组装、形式多样、即插即用、实现工厂性能测试（FAT）、节省占地面积、美观大方和便于操作等优点，符合美国机械工程师协会生物加工设备（American Society of Mechanical Engineers Bioprocessing Equipment，ASME BPE）的设计理念。
  水电解臭氧杀菌的分配框架系统主要由如下元器件组成：水电解臭氧发生器、紫外灯、带变频控制的输送泵、换热器及其冷却调节装置、取样阀、隔膜阀、管道管件、温度传 感器、压力传感器、臭氧传感器、电导率传感器、TOC在线监测仪器、备压阀及其配套的集成控制系统（含控制柜、I/O模块、触摸屏、有纸记录仪等），图5是笔者实践的一个典型的水电解臭氧杀菌分配框架系统。

  
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