【求助】SDS-PAGE蛋白条带模糊？

最新回复

• ALALA (2014-2-03 22:43:21)

  
  是不是上样量有点大啊。

• ALALA (2014-2-03 22:43:52)

  你有没有更换胶的浓度啊?!

• JK.jon (2014-2-03 22:44:08)

  
  分离胶7.5%，浓缩胶5%
  我看了好多图，感觉都不是很清楚
  我是1ml菌体培养物离心，弃上清，加120ul水和30ul的5x上样BUFFER,沸水煮15分钟。取20-30ul上样。

• standup (2014-2-03 22:44:28)

  这应该是电泳缓冲液使用时间过长导致的，用的次数多了脏了就会这样，重新新配就可以了，主要是上槽，上槽buffer是通过胶的，一般上槽用过几次就倒到下槽里当下槽buffer使！

• yychen (2014-2-03 22:44:45)

  我们的电泳缓冲液一般用三次就换了，用到后来对电泳的速度影响很大，电泳跑的很慢。但我觉得你的图电泳缓冲液是一方面问题，我觉得你的上样buffer是不是有什么问题？你再重新配一遍做做试试吧。我也见过那种情况，最终才发现是上样buffer的问题。

• standup (2014-2-03 22:45:10)

  我也遇到这种问题，而且所有条带都特别浅，不知什么原因？
  电泳缓冲液是新配的，如果是5乘上样缓冲液的问题，那又是为什么呢

• vvmmoy (2014-2-03 22:45:38)

  
  1）更不是电泳液的问题，电泳液只会导致电流大小，影响跑胶的速度。即便电泳液很脏，但是那些脏东西能跑进胶里吗？即便跑进去了，能想蛋白一样被染色吗？ 好好分析下。 以后再别因为胶不干净来找电泳液的原因
  2）貌似胶的浓度是小了点。（不知道楼主所说的模糊，是指包括Marker在内的条带也模糊还是说，样品带上太模糊了）如果样品带太模糊，建议再稍微减少样品用量，煮沸后离心2-3min，吸取样品上清点样。
  3）我更坚持的一个观点是，你这个胶照相出问题了，似乎没有对准焦距。如果自己用相继照的，可以再稳当点，锁定好焦距。如果是仪器照相，建议，用一小纸片（带字的）放在你胶的一角，调节焦距，如果能很清晰的看到纸片上的字，再稍微拉大一点点焦距即可（或者把胶的厚度忽略不计，就不用继续拉大）。
  有时候，实验结果很容易出，但必须要仔细处理结果才可以！
  个人意见。

• 红茶可乐 (2014-2-03 22:46:11)

  我也遇到这种问题，而且所有条带都特别浅，不知什么原因？
  电泳缓冲液是新配的，如果是5乘上样缓冲液的问题，那又是为什么呢
  
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  所有条带特别浅 是你的染色液用此次数到期了

• gogo (2014-2-03 22:46:31)

  
  我也遇到过类似情况，经过试剂重配，条带较为清晰。采取的措施有：
  1：在配制分离胶和浓缩胶时，用灭菌蒸馏水，不要用非灭菌蒸馏水。
  2：重新配制TRIS－HCL（PH8.8和6.8），PH值一定要精确。
  3：1％SDS和1％过硫酸铵，要现配现用，要用灭菌蒸馏水稀释。
  4：电泳缓冲液，要现配现用。
  祝成功！

• join (2014-2-03 22:46:57)

  
  我感觉好像也是照相时候没有对准焦距。

• baidukk (2014-2-03 22:47:19)

  
  我以前也遇到这种情况，我认为可能有以下四种情况：
  1. 染色液放置时间太长，因此更换染色液（这个原因排除，你说你用新配的染色液）。
  2. 电泳缓冲液用的次数太多了，一般电泳液最多用两次；此外，电泳缓冲母液应放置4度冰箱保存。
  3. 配置电泳缓冲液的水应为蒸馏水，若不用蒸馏水会出现条带模糊现象。
  4. 可能也与你提的蛋白质量不好也有关系（如提蛋白的试剂配的不对），蛋白质量不好也会出现条带模糊现象。

• panda王 (2014-2-03 22:47:53)

  1）更不是电泳液的问题，电泳液只会导致电流大小，影响跑胶的速度。即便电泳液很脏，但是那些脏东西能跑进胶里吗？即便跑进去了，能想蛋白一样被染色吗？ 好好分析下。 以后再别因为胶不干净来找电泳液的原因
  2）貌似胶的浓度是小了点。（不知道楼主所说的模糊，是指包括Marker在内的条带也模糊还是说，样品带上太模糊了）如果样品带太模糊，建议再稍微减少样品用量，煮沸后离心2-3min，吸取样品上清点样。
  3）我更坚持的一个观点是，你这个胶照相出问题了，似乎没有对准焦距。如果自己用相继照的，可以再稳当点，锁定好焦距。如果是仪器照相，建议，用一小纸片（带字的）放在你胶的一角，调节焦距，如果能很清晰的看到纸片上的字，再稍微拉大一点点焦距即可（或者把胶的厚度忽略不计，就不用继续拉大）。
  有时候，实验结果很容易出，但必须要仔细处理结果才可以！
  个人意见。
  
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  结果照相出问题的可能性比较大。
  第一 调焦距的时候 应选择胶上某一条条带来对照，而不是任意某一点。在你这个照片里面。我可以看到你所用纸张的褶皱，所以对焦的问题你也应该考虑在内。
  第二 上样量，如果你所要检测的蛋白丰度本来就比较高的话，可以酌情减少上样量，否则，则需要提高上样量。

• yychen (2014-2-03 22:48:10)

  
  根据个人经验，是缓冲液和上样buffer的问题。每次重新开始的时候条带很清晰，慢慢就不理想了。如过缓冲液和上样buffer上下点功夫，情况就能控制了。仅供参考哦。

• PPT (2014-2-03 22:48:45)

  结果照相出问题的可能性比较大。
  第一 调焦距的时候 应选择胶上某一条条带来对照，而不是任意某一点。在你这个照片里面。我可以看到你所用纸张的褶皱，所以对焦的问题你也应该考虑在内。
  第二 上样量，如果你所要检测的蛋白丰度本来就比较高的话，可以酌情减少上样量，否则，则需要提高上样量。
  个人一点看法，供参考！
  
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  胶是楼主自己跑的 ，他会因为只看了照片不行，就说胶不清楚吗？？？
  要不你处理后甩一下样品试试吧，这块胶也不是特别的不清楚，只是蛋白丰度较高吧。

• finger (2014-2-03 22:49:26)

  分离胶7.5%，浓缩胶5%
  我看了好多图，感觉都不是很清楚
  我是1ml菌体培养物离心，弃上清，加120ul水和30ul的5x上样BUFFER,沸水煮15分钟。取20-30ul上样。
  
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  1.上样量太多了。1ml的菌，我一般只用5ul上样。
  2.煮沸5分钟。之后10000rpm离心2分钟，再取上清上样。

• TAT (2014-2-03 22:49:54)

  QUOTE:

  原帖由 finger 于 2014-2-3 22:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  分离胶7.5%，浓缩胶5%
  我看了好多图，感觉都不是很清楚
  我是1ml菌体培养物离心，弃上清，加120ul水和30ul的5x上样BUFFER,沸水煮15分钟。取20-30ul上样。
  
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  1.上样量太多了 ...

  同意楼上看法，可以适当的降低上样量，上样前要高速离心，
  还有就是上样buffer，用新配的怎么样。

• huifeng0516 (2014-2-03 22:50:19)

  条带不够锐利，这种情况我也遇到过。当时缓冲液和染色液都是新配的。

• huifeng0516 (2014-2-03 22:50:41)

  
  可以看到你低丰度的条带也不够锐利

• huifeng0516 (2014-2-03 22:51:14)

  
  本人觉得既不是配胶缓冲液也不是上样缓冲液的问题，而是样品处理的问题。楼上有的提过样品在煮过之后高速离心，这一步是必须的。看这张图片最后一道是Marker吗，还是比较清晰的。

• star#room (2014-2-03 22:51:38)

  感觉电泳缓液问题不是太大，我也用过7.5%的胶，电压100V恒压，4摄氏度，大约120分钟，样品12000g4度10min离心后，上样，
  感觉你的样品量还是不算太多，不过少一点会更好，比较容易跑出锐利的条带，我都是用尽量少的量