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【求助】2-D奇怪问题求教
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我是2-DE菜鸟小妹，今天才做第一次。结果发现我昨天配的两管再水化液（含有IPG buffer），各2.5ml，-20保存，有一管冻住了一管还是液态，很是费解，因为以前没有经验所以只好又重新配了才用。
另外，还有个问题，手册上说让在使用之前每2.5ml加7mgDTT，可是我的胶条13cm，每次水花液只用250ul，该怎么加DTT呢？如果以2.5ml为单位加，在冻存后能再使用吗？
还在资料上看到说裂解液也要现用现配，若是-20保存融化后就不能再冻存了，是这样吗？这样不是很费IPG buffer？裂解液里可不可以不加IPG buffer？
问题太菜了，大家不吝赐教啊！！！感谢！！！
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最新回复
xiaoxiaoniao (2014-3-23 21:10:55)
Q:我是2-DE菜鸟小妹，今天才做第一次。结果发现我昨天配的两管再水化液（含有IPG buffer），各2.5ml，-20保存，有一管冻住了一管还是液态，很是费解，因为以前没有经验所以只好又重新配了才用。
A:我觉得可能没有完全混匀，两管成份不同。
Q:另外，还有个问题，手册上说让在使用之前每2.5ml加7mgDTT，可是我的胶条13cm，每次水花液只用250ul，该怎么加DTT呢？如果以2.5ml为单位加，在冻存后能再使用吗？
A:2.5ml加7mgDTT，那250ul当然就加0.7mgDTT喽，不过有点太少了，基本上称不出来，你可以考虑用DTT储液，或者直接配到水化液中，效果是一样的，不用每次都现配的。
Q:还在资料上看到说裂解液也要现用现配，若是-20保存融化后就不能再冻存了，是这样吗？这样不是很费IPG buffer？裂解液里可不可以不加IPG buffer？
A:冻存几次不影响效能的，裂解液要加IPG buffer的，帮助蛋白溶解和稳定蛋白的等电点。楼主可能理解有个错误，DTT和IPG buffer不用只算到水化液，而是按你裂解液和水化液混合后的体积算DTT和IPG buffer就行了
8黑眼圈8 (2014-3-23 21:11:26)
okhaha (2014-3-23 21:11:55)
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不知你配溶液的水是什么水，去离子水？双蒸水？你的试剂纯度很高，质量很好吧? 如果是这样，那么一点都不用担心，这只能说明你的试剂和水都太干净了，一点晶核都没有：）楼主不妨将没有冻上的管子用力甩几下，可能瞬间就冻上了。但这不影响效果的，放心吧！
okhaha (2014-3-23 21:12:13)
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建议你买Amersham的Destreak reagent，它是液体的，主要成分是DTT，还有其他一些去除点脱尾的试剂，你只需要向水化液中加几ul即可，很方便。
okhaha (2014-3-23 21:12:37)
问题太菜了，大家不吝赐教啊！！！感谢！！！
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这要根据你的蛋白浓度具体情况具体分析了。如果蛋白浓度很高，在做银染时，上样体积很少（几ul至十几ul），则裂解液中不加IPG buffer 也行。但如果蛋白浓度低，上样体积很大，就需要加了，否则会干扰水化液中IPG buffer的浓度，影响等电聚焦。
8黑眼圈8 (2014-3-23 21:12:56)
哇,楼上说得很详细啊,不过我甩过我的再水化液,还是没变化呀,水是是去离子的,试剂纯度还可以,不知为何碰见这种怪现象啊,不过,昨天已经做完第一次2D了,正在脱色,期待结果ing...
8黑眼圈8 (2014-3-23 21:13:58)
今天有结果了,感觉我的样品裂解液还是有问题,我提的是植物蛋白,染出来小分子量蛋白很少,几乎没有,觉得不对,酸性大分子量的蛋白很多,聚集在一起,垂直方向有些脱尾,不知道是什么原因,下午附图上来,请大家帮忙分析分析
8黑眼圈8 (2014-3-23 21:14:40)
这是第一次做的结果,感觉好像第二向没跑开似的,上样量大概400ug,是不是太大了?IEF程序:
30V 15h
500V 500vhr
1000V 1000vhr
8000V 11250vhr
8000V 4000vhr
50306550.jpg
xiaoxiaoniao (2014-3-23 21:15:07)
8000V 4000vhr ？
少打了个零？
上样量大了
另外个人感觉除此之外好像还有问题需要解决
尤其是纵向
8黑眼圈8 (2014-3-23 21:15:28)
是4000vhr，没打错，还是ge的一个双向专家建议的，本来设的是0.5hr，基本程序就是13cm胶条说明书上的，但是我看大家的vhr数都很大啊，我的没有那么打，是不是没有聚焦好呢？大家一般都聚焦多少vhr呢？
8黑眼圈8 (2014-3-23 21:15:49)
纵向拖尾又是什么原因造成的呢？我回忆在第二次平衡的时候把胶条给放反了，面朝下，对结果有没有影响呢？
8黑眼圈8 (2014-3-23 21:17:02)
没人理啊?大家帮帮忙嘛,小妹先谢谢了,呵呵.大家一般聚焦多少vhr呢?
gogo (2014-3-23 21:17:42)
我做11cm胶条，pH3-5.6，上样120ug，聚焦40000Vhrs的结果，背景有点高，供你参考吧（见下图）。
1，400ug上样量作银染，实在有点大，
2，聚焦一万多VHR又实在太少了。
3，建议增加几步低电压除盐的过程，如100V 1hr，200V 1hr等，会使你的聚焦结果好些。
4，感觉你的SDS-PAGE胶本身就没制好或没跑好，要加强一下。
76337146.snap.jpg
ztonyc (2014-3-23 21:18:42)
縱向拖尾的原因可能有：
1、玻璃板不干凈
2、平衡過程DTT和碘乙酰胺的量不對或者平衡不充分
3、凝膠聚合不均勻
請你檢查一下自己的過程吧，呵呵
eric930 (2014-3-23 21:19:29)
请问一下，为什么有时在胶条的上端会有密密麻麻的纵条纹呢？扫胶的时候那里的点根本就看不清楚了，平时聚焦设置是１００００，有达到９０００，怎么效果就这么不好。对了，每次上样的时候都会有点沉淀，我觉得会不会是这个影响了呢？怎么解决？谢谢
seagate (2014-3-23 21:19:47)
一向聚焦8000v-0.5h 4000vhr 基本是最小的聚焦极限了
我们适当增加 6000-8000vhr
一向点拖尾：聚焦不足，或离子过高
二向点拖尾：平衡不足，或平衡液有误，玻璃板脏
点模糊：dtt不足或在碱性区段6-11
bluelake (2014-3-23 21:20:48)
我也想问一下，13CM的胶条，聚焦的总伏时数大家一般是多少，GE手册上的伏时数才2万多，我是 42,000VHR，不同样品，有的还行，有的就不怎么样。你们呢？
8黑眼圈8 (2014-3-23 22:15:31)
1.我在跑第二向的时候,溴酚蓝带很宽,就像弥散的感觉,不是一条直线,这是不是由于没有堆积胶引起的?大家一般做不做堆积胶呢?
2.我的蛋白总是感觉跑不到底(10mA跑了4~5hr)溴酚蓝都完全跑出去了,但小分子蛋白部分好像没有点,不知道是不是没跑到底
3.有没有人用过1%SDS,0.375M tris-Hcl ph8.8,50mMDTT,25%甘油这种裂解液.我对比过这种裂解液和尿素裂解液,发现前者溶解的蛋白多,但是那个配方里有SDS,会不会影响等电聚焦呢?
4.怎么加蛋白marker?
问题很多,大家多多帮忙啊a[color=Black
8黑眼圈8 (2014-3-23 22:15:47)
yapuyapu (2014-3-23 22:16:42)
Q:我在跑第二向的时候,溴酚蓝带很宽,就像弥散的感觉,不是一条直线,这是不是由于没有堆积胶引起的?大家一般做不做堆积胶呢?
A:不做积层胶，溴酚蓝带很宽和你的配胶溶液有关，我曾发现我有时配的胶每次溴酚蓝带很宽，有时就每次都很细，和更换Tris8.8有关吧，个人观点
Q:我的蛋白总是感觉跑不到底(10mA跑了4~5hr)溴酚蓝都完全跑出去了,但小分子蛋白部分好像没有点,不知道是不是没跑到底
A:溴酚蓝分子量非常小，小分子量蛋白没跑到底很正常，这个你可以自己摸索条件，在溴酚蓝跑出去后延长十几分钟就可以改善的。
Q:有没有人用过1%SDS,0.375M tris-Hcl ph8.8,50mMDTT,25%甘油这种裂解液.我对比过这种裂解液和尿素裂解液,发现前者溶解的蛋白多,但是那个配方里有SDS,会不会影响等电聚焦呢?
A:SDS会影响等点聚焦，另外我个人不认为前者能比后者溶解多少蛋白，并且前者缺少了双向电泳所需要的一些成分，如两性电解质等，且对于前者溶液的离子浓度深表怀疑，估计以此裂解的蛋白溶液聚焦有难度。
Q:怎么加蛋白marker?
A:看你用的哪种marker，一般是将Marker和2*封胶琼脂糖等体积混合后（煮沸，可选），滴加在约0.5*0.5cm的滤纸片上，放于二相胶条的旁边即可。
Q:我在把胶条往第二相胶上转的时候,总是胶的正面贴着玻璃板,支持膜那面就贴不上,不知道会不会影响SDS-PAGE?总觉得蛋白会跑了胶和玻璃板中间去,呵呵
A:不是很懂你的操作，怎么会胶面贴着玻璃板啊，如果如您所说，那自然时会对二相电泳有影响的。不过我看了半天，着实还是看不懂这段描述，不好意思
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