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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-7-01 15:48 作者: finger 来源: 分析测试百科网
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原帖由 finger 于 2014-7-1 15:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '') 请问各位大侠，正常情况下，30％丙烯酰胺的PH值应是多少？ 我测得PH为6.4．这正常吗？是不是有杂质丙烯酸含量过高？谢谢！
原帖由 finger 于 2014-7-1 15:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '') 谢谢！我是用29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉．加至100ml.试剂是进口的，做了一年多没出问题．昨天新配的东东在灌胶时凝得奇慢．所以在想是不是这个有问题？TEMED应该是没有问题的．还有可能是其它方面的问题吗？ ...
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PINK (2014-7-01 15:48:28)
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如果按正常操作，也就是将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用滤器（0.45μm孔径）过滤除菌后。其PH直应该在6.5－7.0之间，6.4可能是有点偏低，但是如果单纯是为了跑PAGE胶的话，应该没有太大影响。但是要置棕色瓶中保存于室温。finger (2014-7-01 15:48:53)
谢谢！我是用29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉．加至100ml.试剂是进口的，做了一年多没出问题．昨天新配的东东在灌胶时凝得奇慢．所以在想是不是这个有问题？TEMED应该是没有问题的．还有可能是其它方面的问题吗？
pengke1983 (2014-7-01 15:49:16)
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如果你能确定TMEMD没有问题的话，那么其它影响因素还包括配胶其它试剂的配置是否有问题，比如SDS、过硫酸铵的配置，楼主用的30％的丙烯酰胺一直是这样配的吗？我们从来都是按19：1配的。还有就是温度的影响，如果温度低就凝固的慢些，高就凝的快些。还有就是一定要确定配好的分离胶要混匀，否则不但会造成胶凝的慢，凝的不均匀，还会对跑胶的结果造成很坏的影响。fei1226com (2014-7-01 15:51:14)
看看你的过硫酸铵有没有问题，过流酸铵在4度放两个星期后，就不可以再用了，否则就会发生胶凝的慢的现象，甚至胶不能够凝。
kuohao17 (2014-7-01 15:51:46)
finger (2014-7-01 15:52:07)
APS肯定是新配的．一般情况下我只用一周．当然是4度保存．
TEMED上个月还用得很好的．
丙烯酰胺：甲叉 29.2：0.8一直是这个比例．从没出问题．当然也有的是29：1．这个是差不多的．
关于胶是否混匀，我肯定不会有这样的低级失误．做过不知多少遍了．
气温倒是有点低．但上个月温度也低呀，也不至于这么慢．
今天我将TEMED的量增加了近50％．好像快一点．不过仍不理想．
所以出现这个状况很奇怪．所以才来请教各位大侠．不是疑难杂症又何劳何位大侠呢？
问一下各位：你们APS和TEMED的量分别加多少？我浓缩胶4％，分离胶8％．6ml胶里加APS60ul（相当于1％）,TEMED 6ul（相当于0.1％）．
loli (2014-7-01 15:52:32)
你配的胶里面AP和TEMED加的太多啦，不过这不会是胶不凝固的原因，有一种情况，你看一下你的AP是不是放了太久了，我是说固体AP，它是会吸潮的，保存的时候要注意。如果是这样的话，建议你换AP。TEMED应该是装在棕色瓶里的比较好一点。我们是碰到过AP配好后放在室温久了（大约一周多吧），胶不凝固，换上新配的就没问题了。一般10mL胶加50μLAP，TEMED用7－8μL左右。一般SDS-PAGE分离胶用12％的。
回gxhnty ：放在4度当然凝固的慢，放在室温下正常情况1小时左右就会凝固的。太久了还不凝固就有问题了。
祝你们试验成功！
mamamiya (2014-7-01 15:53:01)
刚看了分子克隆第三版其实SDSPAGE胶的凝固主要是丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺在AP作用下发生凝固,TEMED只是促进剂罢了,所以问题是不是丙烯酰胺不纯,本人配制30%溶液没有过滤,直接定容
2541 (2014-7-01 15:53:37)
2541 (2014-7-01 15:54:32)
1、配胶中用到的主要试剂的配置。
主要就是30％的丙稀酰胺的配置。 粉末状的丙稀酰胺和甲叉丙稀酰胺使用不应该超过一年，因为丙稀酰胺会吸潮水解，这样以来丙烯酸的含量就会加大，从而导致page胶不凝。
2、温度。
温度高时凝固快，但是亦不宜过高，因为温度变化会影响交连物的孔径大小。所以温度在25度最为合适。
3、氧气。
氧气是凝固的终止剂，所以不能让胶中出现气泡。
虽然都是些看起来听低级的错误，但是不注意还是会犯。
finger (2014-7-01 16:46:05)
今天再试了一下，气温比较高（24度）。但依然凝得慢。
AP是肯定没问题，我给一做WEstern的同学做了，他的凝得快。
丙烯酰胺没问题，PH正常。
胶里不会出现气泡的，且灌了分离胶后加水覆盖了。不会有这样的失误的。
所以现在高度怀凝TEMED出了问题。
是其中出现了污染物吗？上个月还做得好好的。所以我想不应该是放置过久的原因。那么，各位大侠，什么污染物可使TEMED失效或者效果减弱呢？TEMED可以放多久呢？
am10 (2014-7-01 16:46:32)
你试试灌分离胶后加异丙醇覆盖看看。
祝好运。
finger (2014-7-01 16:46:57)
加异丙醇我是试过的，早在开始弄这个时就做过，跟这个关系不大．
另外，我还发现这两次的胶跟瓷板粘得特别紧，不容易将胶剥离．胶太粘是何原因？
希望继续和大家探讨．
wood533 (2014-7-01 16:47:20)
楼上的你可以再细看是不是配胶的体系问题,前些天,因多加了0.5ml水,胶一直不凝固,TEMED是一种促进剂,加速凝固罢了,而且可以放置一年以后,主要还是30%溶液和AP的问题较大,你再去查查,应该可以凝固
finger (2014-7-01 16:47:57)
今天我重配了AP．然后将TEMED加到了10ul(配6ml胶)．分离胶大约25分钟就凝得很好了．但浓缩胶一直不凝，从上午一直放到下午都没凝．不过总是呈粘稠状态．粘度跟甘油差不多的样子．
我的分离胶浓度是8％．浓缩胶是4％．气温是20度．
这是我做蛋白电泳以来第一次出现这种现象．
各位大侠，试问是何原因？真是愁煞人也．
8princess8 (2014-7-01 16:48:23)
lz的问题我想主要还是温度的问题，建议将胶转移到37C温箱中，一般1h内就可以了。我曾经做过对比，在低温的情况下，丙稀酰铵凝胶会出现凝固慢甚至不凝的情况。
至于浓缩胶，一来可能是凝固慢，二来就是浓度低，4％的胶虽然不至于象甘油一样，但肯定没有分离胶那样有形。
wood533 (2014-7-01 16:52:45)
楼上的说得很中肯！
我也考虑了这个因素了．加温没有用，两个小时都不行．
考虑到胶的粘稠状态，并又重新查阅了相关书籍，觉得可能是胶浓度过低，无法形成网状凝胶．将胶浓度提高至6％，且加了TEMED的量，凝得很好，大约25分钟就好了．
综合几天来出现的状况，我总结了一下．
1.TEMED放置过久，效果有所下降．算来这瓶TEMED已有快三年的历史了．
2.丙烯酰胺：甲叉的比例稍有调整，是29.2：0.8，偏小了点．在低浓度下，交联不够强．
3.气温偏低且胶深度低，导致粘而不凝．
4.灌浓缩胶时过于急躁，胶里有些气泡．
随后我又做了一次5％的浓缩胶，效果亦很好．
因此想到可能在单丙：甲叉＝29.2：0.8的情况下，4％的胶刚好处于形成凝胶的临界．
至此，几日来困扰我的问题总算是基本上解决．
在此，谢谢各位大侠的关心和帮助！
也希望这一次的教训能给大家一些启发．
dog002 (2014-7-01 16:56:08)
说一点TEMED的问题，TEMED是增速剂，本身不参与胶凝固的过程。但是TEMED最好是装在棕色瓶中避光保存，如果是装在透明或者白色的瓶子里最好避光，我用的TEMED一直有一种很重的臭味，如果失效了，可能味道就没那么重了（个人猜测）。我用的是AMRESCO的，不错，用了5年了，没问题。才用了一半不到 ：）从你的描述来看，分离胶没有问题而灌浓缩胶不凝固，2个建议：借一些别人的TEMED来用，还有就是在灌胶前AP和TEMED加入后一定要混匀。如果你有条件，在加入AP和TEMED前可以抽气10－15分钟，这样胶会凝得更好。
dog002 (2014-7-01 17:06:17)
fei1226com (2014-7-01 17:08:22)
问一个弱智的问题,楼上说的抽气是什么意思,在配胶中起什么作用,一般怎么操作?谢谢!
【求助】浓缩胶不凝？