最新更新主题

【求助】Tricine-SDS-PAGE跑不动，而且溴芬兰变黄！

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-3-27 22:32    作者: duoduo    来源: 分析测试百科网

查看完整版本请点击这里：
【求助】Tricine-SDS-PAGE跑不动，而且溴芬兰变黄！

各位战友，最近实验遇到了困难，7kD多肽要用电泳检测，师兄说检测小肽要用Tricine-SDS-PAGE，可是我做了一个多月了，一直都没摸索好条件，主要问题是：
1. 跑不动（电泳2h溴芬兰才刚刚进入分离胶，继续电泳4h溴芬兰才到分离胶中间的位置）
2. 溴芬兰进入分离胶后约2h开始变黄
看了以前的帖子，分析原因可能是电泳缓冲液、凝胶缓冲液和上样缓冲液的pH不对，所以全部重新配的，而且全部一次性，没有重复利用，电泳时正负极间有气泡，说明电路的是通的（不过槽比较旧，接触不良，用皮筋儿勒住上盖就没事了），制胶用的胶条也撕掉了，这个因素也排除，我经验有限，实在找不出问题在哪。
为了让大家帮我分析原因，我把我的溶液配置、实验方法和电泳图发上来
1. 30%丙烯酰胺溶液
2. 凝胶缓冲液
三羟甲基氨基甲烷（Tris）    36.3g
SDS        0.3g
溶于80ml水，盐酸调pH至8.45，定容至100ml。2~8℃保存，3个月内使用。
3. 正极缓冲液
三羟甲基氨基甲烷（Tris）    24.4g
溶于800ml水后，盐酸调pH至8.9，定容至1000ml。4℃保存。
4. 负极缓冲液
三羟甲基氨基甲烷（Tris）    12.2g
SDS        1.0g
Tricine        17.9g
溶于800ml水后，盐酸调pH至8.25（未调时测pH为8.24），定容至1000ml。4℃保存。
7. 2×样品缓冲液（10ml）
浓缩胶缓冲液  0.48ml
80%甘油    5.0ml
10% SDS    0.8ml
1%溴酚蓝    0.2ml
1M DTT   2ml
水    1.4ml
制胶：
16%分离胶：（6ml）
30%丙烯酰胺溶液    6.4ml
凝胶缓冲液    4.0ml
甘油      1.6ml
10%过硫酸铵    60ul
TEMED      6ul
4%浓缩胶：（5ml）
30%丙烯酰胺溶液    0.67ml
凝胶缓冲液    1.67ml
水      2.50ml
10%过硫酸铵    50ul
TEMED      5ul
点样：以10ul/孔
程序1：恒压40v，至进入分离胶（约2.5h）
程序2：恒压100v（跑至分离胶一半约用4h）
固定，染色，脱色（这三步应该没问题）
请大家帮帮我~这步电泳对我的实验和毕业都非常重要~~~
查看完整版本请点击这里：
【求助】Tricine-SDS-PAGE跑不动，而且溴芬兰变黄！


90133773.snap.jpg


我也来说两句 查看全部回复

最新回复

  • fsdd817 (2014-3-27 22:33:27)


    1 上样量太多。减少到1/5－1/10试试看。
    2 电泳好像没有什么问题。tricine胶是要跑得慢一些，且胶浓度也大。你电压太低，自然跑得慢。如果玻板不会裂，可以直接100V电泳。我用北京六一的电泳槽（约8×10cm），都直接150 V。
    3 溴酚蓝变黄，是因为pH低的原因。只要电泳分离好，影响不大的。

  • tuuu2 (2014-3-27 22:33:51)

    1. 30%丙烯酰胺溶液
    改为49.5％（Acr48.0g，Bis1.5g）
    4. 负极缓冲液
    三羟甲基氨基甲烷（Tris） 12.2g
    SDS 1.0g
    Tricine 17.9g
    溶于800ml水后，盐酸调pH至8.25（未调时测pH为8.24），定容至1000ml。4℃
    保存。
    这个不用调pH配制后应该在8.3左右。
    7. 2×样品缓冲液（10ml）
    可以配成4x的
    制胶：
    16%分离胶：（6ml）
    DDW 1.2ml
    49.5%丙烯酰胺溶液 2.0ml
    凝胶缓冲液 2.0ml
    甘油 0.8ml
    10%过硫酸铵 60ul
    TEMED 6ul
    点样：以10ul/孔（可以稀释2－5倍上样）
    程序1：恒压40v，至进入分离胶（约2.5h）
    程序2：恒压100v（跑至分离胶一半约用4h）
    电压太小了，蛋白容易分散。可以直接恒流20－30V（根据自己的电泳仪选择）
    固定，染色，脱色（这三步应该没问题）
    嗅酚蓝变黄是缓冲偏酸了。不知是否与你调了缓冲的pH有关

  • yjf1026 (2014-3-27 22:34:11)


    你的问题和有可能出在缓冲液上。如果PH没有调准，就会出现跑不动，发热量高的问题。

  • utt0989 (2014-3-27 22:34:31)

    样品中的氢离子浓度高了 修芬兰就会变黄的

  • gogo (2014-3-27 22:34:49)

    你的阳极buffer和阴极buffer互混啊,在电泳的过程中,做tricine电泳,要切记不能互混电极缓冲爷,你可把电泳内槽拿出来加入buffer,如果漏的话,则不行,一定要确保不漏才保证阳极buffer和阴极buffer不互混啊

  • duoduo (2014-3-27 22:35:17)

    样品中的氢离子浓度高了 修芬兰就会变黄的

    ===============================================================================================

    样品都是一样处理的，之间应该没有什么差别，而且都是在进入分离胶后才开始慢慢变黄，而且总是从中间向两周扩散呢？

  • duoduo (2014-3-27 22:36:11)

    你的阳极buffer和阴极buffer互混啊,在电泳的过程中,做tricine电泳,要切记不能互混电极缓冲爷,你可把电泳内槽拿出来加入buffer,如果漏的话,则不行,一定要确保不漏才保证阳极buffer和阴极buffer不互混啊

    ============================================================

    确实有点漏，不过漏得很慢。
    我的电泳是自始至终都跑的很慢，难道漏过去几滴就会有那么大的影响吗？

  • redbutterfly (2014-3-27 22:37:19)

    样品呈现酸性，当指示剂了，哈哈，
    重新配吧，我也范过同样的毛病

  • gogo (2014-3-27 22:37:42)

    漏的话,你的阴极和阳极缓冲液就混了,PH就不对了啊,这和一般的SDS-PAGE不一样,混了还能用啊.
    这个你看看,尽量不漏啊,其他的按照protocol来应该没问题的啊.

  • 7437654 (2014-3-27 22:38:04)


    样品都是一样处理的，之间应该没有什么差别，而且都是在进入分离胶后才开始慢慢变黄，而且总是从中间向两周扩散呢？
    -----------
    兩邊有加BUFFER嗎?不過如果10道全部滿的話,周邊是有點影響的
    看圖,和LS說的一樣,减少上樣量吧,一般MINI膠都是用30mg的上樣量
查看全部回复 我也来说两句
查看完整回复请点击这里：
【求助】Tricine-SDS-PAGE跑不动，而且溴芬兰变黄！