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[讨论帖]“黑胶虫”问题

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2011-12-08 15:27    作者: vvmmoy    来源: 分析测试百科网

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[讨论帖]“黑胶虫”问题
[讨论帖]“黑胶虫”问题（转载）


有关细胞技术的热门话题——“黑胶虫”问题


1.我们实验室最近一次的情况:
我们前后从上海细胞中心买了三批细胞，细胞刚到的时候，观察均生长良好，密度适中，培养液清亮，也没有见小黑点，但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点，有时候在一夜之间暴长，给培养液加庆大霉素，也无济于事，对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少，但是随后几天又出现，刚开始怀疑操作有问题，但是由有经验的老师操作也出现这种问题，陆续对培养液，血清及胰酶进行培养也没发现问题。
同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养，生长快，很快铺满，仔细观察也可以见到少量的黑点。
后来还有从军科院过来的Hela细胞，没有使用我们的血清，直接吸出多余的培养液后，进行培养，传代后用原来吸出的培养液进行培养，同样发现了问题。
可以发现如下的特点：
（1）  与细胞共生，细胞长的好或密度大的话，小黑点就少，反之则 多；
（2）  对抗生素无效；
（3）  可能通过培养箱空气进行污染；
（4）  单用培养液及血清培养没发现问题。
（5）  换掖冲洗后也无效。

以下是论坛里我找来的相关帖子内容
“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。
“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候， 细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。
目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物，增殖缓慢但对细胞有损害，数量达到一定程度可引起细胞死亡，其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。该污染在全世界细胞实验室中普遍存在，解决该问题是一个世界性难题
关于是什么的问题的讨论
A.  玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西（曾经有文献报道过）
B.  据说这是黑胶虫，又有人说是原生动物，好象也没个统一的说法
C.  据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。
D.  有人说是纳米级的细菌

其他的特点
（1）形态上有些像细菌，直径约在0.5~1微米，
（2） 在400X倒置显微镜小，有典型的布朗运动（不规则的原地小距离抖动）。
（3） 细胞内好像也有存在，
（4） 但并不引起培养液混浊
（5） 时间稍长，细胞状态明显恶化，并最后死亡

大家的处理：
1.换好一点的血清（我觉着和血清的关系不大）。
2.如果是贴壁细胞的话，可用无菌的PBS洗几次，可一定程度上缓解。若是悬浮的话，就不太好处理拉，可以向其中少加一点滋养细胞（从小鼠腹腔内取的巨噬细胞，这种细胞不分裂，过一阵就死掉了，做抗体杂交瘤融合的同志肯定知道）。加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效！还有就是实验环境要注意好，保持细胞间整个环境的洁净度。
3.换用进口的一次性塑料培养瓶。
4.建议清理无菌室所有物品，重新灭菌，用KMnO4熏蒸，按首次使用无菌室做，细胞重新复苏，。
5. 在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打，冲洗干净后再加入培养液，坚持天天洗，传代时加生理盐水再离心一次，接种密度稍大一些，一段时间后，虫子就会大大减少，对细胞的生长也不会有大的影响。
6.有材料称minocycline具有一定的作用，可以和换液结合起来使用。
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  • 彼岸花opp (2011-12-08 15:28:33)

    最近培养的Hela细胞，经住了考验，小黑点变的细碎，也不在动了，但是还有一个细胞株仍然存在问题！附上照片，10×20


    42887468.jpg

  • 园丁## (2011-12-08 15:28:57)


    杀黑胶虫培养基在这里有卖 , 中国医学科学院肿瘤研究所肿瘤生物学检测中心cuturl('http://www.cicams.ac.cn/marker/service.htm')

  • 中国特色 (2011-12-08 15:29:21)

    很难根除。

    最好的办法就是舍弃并进行全面的熏蒸杀菌

    我们实验室也污染了一次，后来熏蒸了一个星期，换气也用了1个星期，后来就好了，期间我也用什么换血清等方法弄过，不过作用不大，过几天那个又多了。呵呵

    还是彻底的消毒一次好啊。

  • loli (2011-12-08 15:29:44)


    我近期培养的细胞中也发现类似的东西, 不知是不是黑胶虫污染, 曾经将其涂片及细菌接种均没发现细菌, 但我的细胞状态不好, 有较多碎片.

    请教对实验室全面消毒必须用熏蒸吗?我用新洁尔灭擦洗后再用紫外线照射不可吗? 实验进展严重受阻了.

  • duoduo (2011-12-08 15:31:45)

    你怎么知道它不是支原体污染呢？应该首先进行支原体的检测。黑胶虫之说很难让人信服。

  • pengke1983 (2011-12-08 15:32:07)


    我的细胞也遭此大难，状态不好，看了感觉很有帮助，谢谢！

  • DNA (2011-12-08 15:32:45)

    同感同感！我们试验室的细胞全面染菌，像极了“黑胶虫”，这家伙很顽固，那都有，我们都无从下手了，上面说过它的直径是0.5-1微米的话，用0.22的滤膜应该能滤掉呀，我在刚买的血清空培养中发现了它，现在根本不敢复苏细胞，快疯掉了

  • ha111 (2011-12-08 15:33:05)


    各位战友:
    我是进行海马神经元培养的,也发现在培养的后期开始出现黑色点点,而且不像是死细胞,应为是成大片状,根据上面所描述的有可能是黑胶虫感染,想问问是不是与培养箱污染也是有关的?经常打扫培养箱能根除吗?

  • 铜雀 (2011-12-08 15:33:29)

    啊！我们实验室也遭过的！但是同一个培养箱里有的有，有的没有，不知道怎么回事！

  • one (2011-12-08 15:33:55)

    可能就是所谓的黑胶虫，我们实验室昨天刚发现这种情况，细胞消化离心后，在离心管底部肉眼都能清楚地看到黑色的颗粒！
    不知道该怎么做才好

  • 小鱼鱼 (2011-12-08 15:34:17)


    我养的内皮细胞也发现了类似的现象，我估计是这个问题，有很多小小的黑色颗粒，因为我买的血清是国产四季青的，我决定换成paa的，看是否还有问题

  • 月牙牙 (2011-12-08 15:34:38)

    我养的是PC12细胞 里面也有好多小片片 黑色的 。可是又复苏一枝 还是有，细胞现在长得很慢 ，不知是不不是这原因

  • lixi559 (2011-12-08 15:35:10)

    我养的人的肝细胞也出现类似上面楼主说的“黑胶虫”。自己的观察和楼主还是有点区别：我用条件培养基(不含血清和二抗)长期培养细胞，每两天就更换，新配的培养基。在培养一个星期就出现类似“黑胶虫”的东西。胞浆和上清中均有那种东西，换液以后好像澄清了一点，第二天又出现了，这东西对细胞的生长也有些影响，细胞有的脱落死掉了。因为培养时间不久，还不知道是细胞在培养的过程中本身的原因还是黑胶虫的的影响。可以肯定可以和细胞共生。奇怪的是：我在用含血清（PAA公司小牛血清）培养基作对照的六孔板中发现，那上清中却是澄清的，三个复孔也是澄清的。
    1.当时怀疑是我是不是没加二抗的原因，后在条件培养基中加入二抗以后，发觉效果还是不明显。
    2.怀疑是不是条件培养基本身就含有那东西，于是将一部分培养基也放入培养瓶中培养。也没发现有那东西。
    最后个人的结论：这种东西在可能本身就寄生于人和动物的细胞内。二抗对其效果不明显。血清中可能存在有一种物质可以抑制其生长。细胞离开特有的免疫环境，很多被抑制生长的，寄生于细胞内的生物就开始生长，这种情况类似于HIV感染引起的感染一样。
    解决的办法也是很迷漫。至今也没什么办法。
    在和群友们的的交流和学习中找到对付这种黑胶虫的办法。

  • 泡泡 (2011-12-08 15:35:31)

    我现在有点怀疑是不是支原体污染，今天我做了一个小小的测试，把不加任何细胞的培养液在加到一个小皿中，同时穿了一瓶被污染的细胞，6小时后观察，只有传代的有小黑点在动，只加培养液的小皿里面没有，我想这已经说明不是血清的问题，是不是也说明不是黑胶虫污染，而是支原体的问题呢？

  • 泡泡 (2011-12-08 15:35:49)

    作了一个小小的测试，又感觉不是黑胶虫污染了而是一般的支原体什么的，测试如下：
    我把新鲜的培养液加到一个小皿里面，里面不加任何培养物，6小时后观察，结果没有小黑点出现，而传入细胞的那一个一定有了？这是不是说明血清没有污染，也间接的说明不是黑胶虫污染呢

  • ffooll (2011-12-08 15:36:18)


    我养的细胞也出现了你说的情况,老师说使衣原体感染,可是不知道怎么检测是衣原体感染?老师没说我也不知道.能告诉我吗?谢谢了!还有啊我分别培养了胰酶和培养液感觉培养液里有了,可是别人和我用的是同一种培养液怎么没事呢?好奇怪啊!!

  • vvmmoy (2011-12-08 15:36:56)

    有关血清使用中的常见问题解答


    有关血清的问题，数十年来我们始终面临的是同样的问题。因此，我们特别整理了一些实验室里常会遇到的问题，供大家参考：

    1.保存血清最好的办法？

    我们建议血清应保存在-5℃至-20℃。若你一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

    2.如何解冻血清才不会使产品质量受损？

    我们建议您将血清从冷冻箱中取出后，先置于2-8℃冰箱中使之溶解，然后在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。

    3.血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理？

    血清中沉淀物的出现有许多原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性造成的；而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。

    若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管中，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。

    4.何谓热灭活？有必要做热灭活吗？

    一般以56℃，30分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活性，而补体所参与的反应有：溶细胞活性，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

    实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经过处理的血清对细胞生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。

    而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者认为是微生物的分裂扩增。

    因此我们建议您，若非必须，您可以不需要做热灭活这一步。如此以来，不但节省您宝贵的时间，更确保您血清的质量！

    5.如何避免沉淀物的出现？

    我们建议您在使用血清的时候，注意正确的血清解冻步骤，并尽量避免灭活血清及长时间的将血清置于高温环境中。

    来源：cuturl('http://www.perbio.com.cn/Hyclone/page/note.htm')

  • vvmmoy (2011-12-08 15:37:13)

    我认为所谓”黑胶虫“应该是血清中的物质在热灭活后形成的聚合物，在常温下做无规则的布朗运动，看上去像虫子而已。因为血清中的营养物质聚合，变得不能被细胞利用，所以细胞失去营养支持，逐渐”状态不好“，甚至死亡。

  • 爱老虎游tt (2011-12-08 15:37:46)

    我的细胞昨天下午观察时，在培养基中也观察到了做布朗运动的“小黑点”。
    今天看了群友们的帖子，有了进一步的了解。
    可是，我到底该如何解决呢？
    有没有明确的解决方案呢？

  • wu11998866 (2011-12-08 15:38:09)


    这些天正为这些“小黑点"烦恼,细胞状态明显变差.变圆,脱落。悬浮细胞也有同样问题。今天重新复苏，看一看。谢谢各位了！
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