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单细胞技术让这些研究成为现实

2016.10.31

　　如今，细胞群体的平均值数据已不再能够满足研究的需求。研究人员开始转向单细胞来探索基本的生物学。在这一期的《BioTechniques》上，Jeffrey Perkel博士介绍了让单细胞实验成为现实的技术。

　　2015年底，巴西卫生部门和世界卫生组织报告，新生儿中小头症的发病率急剧增加。没过多久，人们就确定了罪魁祸首：寨卡病毒（Zika）。为何这种病毒在成人中的表现是如何温和，但在新生儿中却造成灾难性的神经畸形。单细胞生物学将告诉我们答案。

　　走进寨卡病毒

　　加州大学旧金山分校的Arnold Kriegstein获得了奥巴马政府的BRAIN计划资助，希望能分类人脑中的不同细胞。在发育的大脑中研究基因表达，这不是一个新概念，许多研究团队已经做过，但是在大块组织水平。这些研究鉴定出不同区域和不同发育阶段的基因表达差异。不过，他们不能提供细胞特异性指纹。

　　为了创建基因表达的指纹，Kriegstein的团队与Fluidigm公司合作，利用自动化的微流体平台 – C1单细胞自动制备系统。C1能够平行捕获800个单细胞，然后分离、逆转录并扩增，输出单细胞cDNA。将这种工具应用在大脑组织上，研究人员之后在Illumina的测序仪上进行测序，并利用分层聚类工具来分类，每一类代表一种特定的细胞类型。在最初的演示中，他们收集了600多个细胞的表达谱，并将它们分成四大类。

　　这些数据对于解析寨卡病毒的发病机理特别有用。其他研究人员则在研究病毒的受体。一名博士后研究人员Alex Pollen注意到，一种潜在的寨卡受体AXL，在放射状胶质细胞中高度富集。“如果你试图产生小头症，这些正是你想要瞄准的细胞，”Kriegstein表示。其他细胞也表达AXL，包括神经免疫细胞、内皮细胞和眼睛中的某些细胞，但是神经元大多缺乏AXL表达。“你必须逐个细胞地观察基因表达模式，”他说。“幸运的是，我们一直这么做。”

　　发现非整倍体

　　其他的研究团队在探索单细胞时，也发现了独到的生物学见解。事实上，单细胞研究的文章数量在急剧增加，从2010年的46篇增长到2015年的332篇。过去的研究仅限于细胞解剖和生理学，但如今研究人员拥有新一代测序仪和质谱仪，能够拷问单个细胞的分子内容。

　　然而，这并不是一件简单的事。单细胞中没有足够的DNA或RNA用于直接测序，因此这些大分子首先必须被扩增，这不可避免地让人担心扩增偏倚。蛋白质组学和代谢组学研究并没有这种选择，因此研究必然会推动仪器发展。当然，在分析单个细胞时，区分真正信号和随机噪声也是相当复杂的。

　　弗吉尼亚大学医学院的助理教授Michael McConnell正利用单细胞技术来研究大脑中的遗传变异。十五年前，他及同事利用荧光显微镜和染色体绘画技术，发现哺乳动物大脑中的细胞在基因组水平上并不完全相同。大约三分之一的分裂细胞要么缺失大量的遗传物质，要么过量，产生遗传镶嵌。

　　如今，McConnell与Salk研究所的Fred Gage合作对110个单细胞进行测序和SNP分析，以便深入研究“体细胞嵌合”的现象。他们发现，大脑中13-41%的细胞含有Mb大小的拷贝数变异，这些重复和缺失小于十五年前描述的非整倍体，但仍有可能影响细胞表型。“这可能改变离子通道组成，进而直接影响生理学，”他说。

　　长翼的小鼠？

　　宾夕法尼亚大学Perelman医学院的James Eberwine是现代单细胞生物学的先驱之一。自八十年代后期以来，他一直在开发和改进在细胞水平上分析基因表达的方法。据Eberwine介绍，单细胞方法提供的信息无疑会被群体水平的信息所掩盖。他的实验室已利用这种技术来记录细胞之间的mRNA丰度差异，捕获神经树突中的RNA，这个区域曾被认为缺乏转录本。

　　不过他也强调，这项技术必须谨慎使用。“我想让人们知道的是，现在开展单细胞分析是相对简单的，但想要做好，并不简单。”数据解释和对照是关键。

　　Rusty Lansford也同意这一点，他是南加州大学和洛杉矶儿童医院的副教授。与Eberwine合作，Lansford最近转向单细胞组学，将这些技术与脊椎动物胚胎发育的活细胞成像相结合。他的研究对象是日本鹌鹑。对于这类研究而言，鹌鹑是比小鼠和鸡更好的选择。Lansford称之为“长翼的小鼠”。

　　Lansford的实验室一直在开发鹌鹑发育过程中细胞运动的成像方法。他在一个胚胎所有细胞中利用组成型启动子表达红色荧光蛋白，而另一个胚胎利用内皮细胞特异的启动子表达黄色荧光蛋白，之后将动物杂交。Lansford利用共聚焦或双光子显微镜来观察发育中的胚胎，看看每个细胞去哪里。

　　在发育一段时间后，他们切下特异细胞，利用免疫组化鉴定细胞类型，然后测序RNA。尽管数据还没有发表，但是研究人员利用这种策略来标记原始生殖细胞，发现他们能够观察到每个细胞发育过程中的转录组变化。这些实验颇有挑战性，不过数据分析要困难得多。“我们必须查看某些事件，了解细胞事件的随机性，”Lansford说。

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周锦帆