质谱沙龙第三十三期活动报道

2011-9-28 11:53 来源: 分析测试百科
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  2011年9月25日,第三十三期质谱沙龙活动在北京大学分析测试中心成功举行。来自第二炮兵总医院、北京大学、中科院微生物研究所、中国医学科学院基础医学研究所、空军总医院、AB SCIEX公司、北京艾米诺医学研究有限公司等,近四十位专家、学者、技术工程师参加了本次沙龙活动,本次沙龙以大分子为主题,共同探讨质谱技术及其在生物蛋白方面的前沿应用。

质谱沙龙活动现场

用电喷雾离子阱质谱及离子迁移质谱研究四链体DNA的形成、性质和与小分子的结合

  北京大学分析测试中心周江老师作了题为《用电喷雾离子阱质谱及离子迁移质谱研究四链体DNA的形成、性质和与小分子的结合》的报告,主要介绍了电喷雾离子阱质谱观测四链体的形成、构象变化、以及与小分子结合能力,并介绍了离子淌度质谱及其在四链体研究方面的应用。

北京大学分析测试中心 周江 老师

  四链体的形成

  周老师选择的目标靶点是端粒,主要是抑制端粒酶,想在端粒末端的富集序列做些工作。所选择的序列主要有以下一些:尖毛虫和四膜虫等原生动物的端粒序列,人类的端粒序列和c-myc序列。其中,在原生动物体中的端粒序列,X代表T、A、C三个碱基,形成四面体结构,4个G形成一个平面,中间的金属离子起到配合作用,即形成了一个相对稳定的四链体结构,举了半月形链状分子和平面分子的例子。把Q2与Q3混合在一起,只有各自四链体的结构,没有混合和自我杂交的结构,这个结果是没有经过退火得到的。当把G链延长,发现了n-1规则,就是说G平面比那中间的阳离子是刚好是多一个,这在质谱上看是很明显的,通过数字可以很精确地算出来,5个G的是4个NH4+,7个G的是6个NH4+,所以用质谱确定是个很迅速的过程。

  四链体与小分子结合及其性质

  四链体与小分子结合的强弱,跟位点有关,跟小分子结合的模式也是不太一样的,相比较而言,结合程度Q2>Q1>Q3。对于稳定性,通过提升温度而产生单链,单链与四链的比值发现:不加小分子,稳定性依次是Q2>Q1>Q3;加了小分子后,链状的小分子使之提升了一点,而平面小分子使之显著提升,而总体的稳定性顺序是保持一致的。

  周老师重点做的是人体端粒序列,这对人类抗癌有现实意义。在长的序列后面来设计一个分子开关,来控制稳定四链体结构。人类端粒序列有下面四种模式,一是反向平行模式有两种,一是正向平行的模式,还有就是混合模式。在过程研究中,反向平行的在295有一个正峰,260有一个负峰,而正向平行在260有一个正峰。若只在水中,峰是杂乱无章的,而若加一点阳离子,峰立马在质谱里就变得很漂亮,因此,阳离子对四链体的结构起到了稳定的作用。同样是这个东西,加入小分子也可起到稳定的作用。在退火之前,加入平面小分子可以看到结合峰,退火之后就看不见了,这就说明小分子对四联体的构象有一定的选择性。接下来,周老师介绍了特异选择性的例子,并在生物方面做了些实验,验证了这分子有一定的抗癌活性。

  离子淌度质谱及其应用

  周老师在UCSB做离子淌度是比较早的,当时还没有商业化的离子淌度质谱。离子淌度腔(Drift Cell)是其重要组成部分,它只有几个厘米,里面有环片电极并充满氦气,离子将受到两个力的作用。在它前面是一个漏斗,后面是一个Quadrupole,最后是检测。同时,它外面的腔是可以做升温和变温实验的。离子在Drift Cell内受到的两个力,一个力是往回拽,另一个力就是往前推,分子在里头就会因此而分离,从而能够区分5%以上的构象差异。

  周老师所做的工作是关于四链体的,验证退火的作用。退火之前是712,退火之后是752,这就说明退火之前以反向为主,退火之后正向增加了很多。在质谱里看到的三个峰,并不知道它具体有些什么变化,然后再拿这个峰来做离子淌度,可以得到一个分布。我们可以大胆地推测,其既有反向平行,又有正向平行,或者其它的构象,实际在计算中也是支持这个结果的。下面,周老师举了一个与小分子结合的例子,在加入小分子后,正向平行向反向平行转化。离子淌度质谱最大的优势,在做A4结构的时候,因为它只有一条链,缠绕之后该是几个电荷还是几个电荷,同时没有很明显的加和峰。一条链的时候,有了离子淌度质谱,起码可以知道构型发生了怎样的变化,是否符合四链体的结构,并对构象变化作出准确的预测和判断。

热纤梭菌细胞壁蛋白质组及糖基化修饰研究

  中国科学院微生物研究所罗元明老师作了题为《热纤梭菌细胞壁蛋白质组及糖基化修饰研究》的报告,主要介绍了建立MALDI-TOF-TOF质谱研究糖蛋白的方法学,热纤梭菌(C.thermocellum)细胞壁蛋白质组及糖基化修饰研究等内容。

中国科学院微生物研究所 罗元明 老师

  利用RNase B建立MALDI-TOF-TOF研究糖基化的方法学

  糖蛋白研究是相对比较难的,常见的糖基化连接方式有N-连接的和O-连接的。罗老师在研究细菌糖蛋白时,首先建立糖蛋白研究方法学。将糖蛋白样品经一维胶或2DE分离,然后分别用胰蛋白酶切结合蛋白酶K、直接用蛋白酶K以及胰蛋白结合Pronase E等三种方法胶内酶切产生糖肽,并进行MALDI-TOF/TOF MS分析,从而建立糖蛋白快速鉴定方法。

  热纤梭菌细胞壁蛋白质组及糖基化研究

  热纤梭菌是嗜热产芽孢的革兰氏阳性厌氧菌,分泌多种纤维素降解酶,胞外组成纤维小体,胞外降解纤维素得到纤维糊精,进而产生乙醇和氢气。为什么要做细胞壁糖蛋白研究呢?因为它可能和乙醇和氢气的产生过程有关系。为此,罗老师采取了如下的技术路线。首先采用荧光燃料染色法及糖肽质谱分析法来确证蛋白样品中是否有糖蛋白。常用的荧光染料是Pro-Q Emerald 488。其优点是特异性强,灵敏度高,能够从全局角度提供糖蛋白存在的初步信息,成为目前糖蛋白检测的常用方法之一。结果表明,经荧光染色及糖肽分析法确证细胞壁样品中确实有糖蛋白存在。罗老师在初步实验中选择了胞外溶质结合蛋白和烯醇化酶进行进一步的糖基化位点及糖肽结构鉴定。经过MALDI-TOF-TOF MS/MS分析,发现有质量数相差162和203的系列碎片离子存在,表明这两种蛋白为含Hex及HexNAc的糖蛋白。对于下一步工作,罗老师想进一步利用高分辨质谱及尽可能多的糖蛋白标准,建立较为完善的N-连接糖蛋白结构数据库。

液质联用质谱在临床蛋白质组学研究中的应用

  中国医学科学院基础医学研究所孙伟老师作了题为《液质联用质谱在临床蛋白质组学研究中的应用》的报告,简要介绍了他所在实验室的仪器情况,主要介绍了蛋白质组学研究与分析。

中国医学科学院基础医学研究所 孙伟 老师

  孙老师所在的质谱中心前几年购买了赛默飞世尔科技的液质联用仪器,去年从AB SCIEX公司购买了TripleTOF 5600质谱系统,今年刚安装完成。

  尿蛋白质组学研究是孙老师在读博士时做的,当时做体液蛋白质组学研究的人很多,而血液复杂度很高,所以,孙老师选择了易取材、复杂度低,而又反映全身状况的尿来做。最早做尿的是在97年,当时采用SPE(C18)-SCX-RP-ESI-MS方法,可以鉴定三十多个蛋白;到2001年才出现了真正意义上的尿蛋白质组学分析,使用RP-Q-TOF,能够鉴定124个蛋白;2002年,分别采用丙酮沉淀、超速离心和2D-gel-MALDI-TOF方法,鉴定出47个蛋白;2004年,采用SEC-IASC-2DE-MALDI/ESI-MS方法,鉴定出150个蛋白。而孙老师采用1DE、1DLC/MS/MS和2DLC/MS/MS方法,共鉴定出226个蛋白,还鉴定出一些低分子量蛋白。随着近年质谱仪器的不断更新,鉴定的蛋白越来越多,一次实验可鉴定出1500个蛋白。

  接下来,孙老师介绍了Thermo的LTQ Velos Orbitrap仪器,BSA的检测灵敏度可达到100amol, 一次2个小时的实验即可鉴定出1500多个蛋白。另外,孙老师用该仪器做了妊娠糖尿病唾液蛋白质组分析,采用1DLC方法分别分析了GDM组和对照组,18种蛋白在2型糖尿病患者唾液中显著升高,而且这些蛋白与胰岛素抵抗或糖尿病血管并发症有关。随着仪器的进展,高分辨率的质谱仪将成为以后蛋白质组学研究的主要工具。

专题讨论:质谱技术在生物大分子领域的应用

  本次互动交流与专题讨论的主题是:质谱技术在生物大分子领域的应用,由AB SCIEX公司李春波博士主持。

AB SCIEX公司 李春波 博士

  应用于生物大分子领域的质谱技术主要有MALDI-TOF和ESI-MS两方面,用于核酸和蛋白质的鉴定、定量和修饰研究。蛋白质组发展的趋势,正在从发现蛋白质组迈向靶向蛋白质组。如何实现定向蛋白质组(MIDAS技术流程)?这就需要定向蛋白质研究核心技术QTRAP质谱。MRM究竟有哪些优点?检测灵敏度比传统的扫描模式高500-1000倍,特别适合低丰度蛋白的鉴定;定量的线性范围宽,大于6个数量级(其它技术只有4个数量级左右),特别适合样品含量有显著差异的样品分析;扫描速度快,结合Schedule MRM软件,一次质谱扫描实验可以完成上千对MRM,因此可以同时检测几百种蛋白质的含量变化;采用MRM方法定量已经成为小分子领域定量的黄金标准,技术成熟,使用简便,在蛋白质组学中的应用现在正处于黄金时期,结合临床样本,容易出高档次文章。定向蛋白质组可以解决定向定性蛋白质组学的单肽段蛋白质鉴定的确认,复杂样本低丰度蛋白的检测和靶向翻译后修饰位点鉴定;还可解决定向定量蛋白质组学的生物标志物确认、定量,信号通路分析、翻译后修饰的定量动态描述等问题。

AB SCIEX TripleTOF™ 5600系统

  AB SCIEX TripleTOF™ 5600系统是最快、最灵敏的高分辨率质谱,能够充分满足高标准的定性和定量分析需要。一个平台就能够涵盖蛋白质组学的定性和定量研究,创新源自AB在质谱定量领域的领导性技术创新。AB SCIEX TripleTOF™ 5600系统具有高分辨率、高质量准确度、高灵敏度、高采集速度和高定量线性动态范围,在MS和MS/MS,在定性和定量,总是同时到达。