NGS文库制备的方法比较

2014-2-12 14:47 来源: 生物通
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  近年来,新一代测序(NGS)技术的应用日益广泛。随着测序技术的不断改进,制备核酸和构建NGS文库的方法也在改进。对于各种文库制备方法,我们该如何选择?近日,美国斯克里普斯研究所的研究人员在《Biotechniques》上发表文章,比较了各种文库制备策略。

  总的来说,在NGS分析之前,制备RNA或DNA的主要步骤包括:片段化和/或筛分指定长度的目标序列;将目标片段转化成双链DNA;在片段末端连上寡核苷酸接头;以及定量最终的文库。

  DNA片段的大小是NGS文库构建的主要因素。DNA片段化主要是通过物理方法(如超声破碎)或酶学方法(即非特异的核酸内切酶处理)来实现的。作者将这两种方法进行了比较,发现它们都很有效。不过,与物理方法相比,酶学方法(Fragmentase)产生更多人为的插入缺失。作者还提到了Illumina的Nextera技术,认为它能够减少样品处理并节约时间。

  作者提到,在制备DNA样品的文库时,应考虑几点,包括起始材料的量以及测序应用。若基因组的GC含量较高或较低,文库制备有可能会出现偏向。此时应精心选择PCR扩增的酶、条件以及缓冲液,来解决这些问题。

  目前有多家公司提供制备DNA测序文库的试剂盒。竞争使得价格稳步下降,质量不断上升。这些试剂盒可从微克至皮克级的起始材料开始制备文库。不过,大家应该记住这一点,起始材料越多,意味着扩增越少,文库复杂性越好。

  对于RNA测序实验,作者认为,在决定文库制备的方法之前应考虑实验的主要目的。如果目的是发现复杂和整体的转录事件,那么文库应捕获整个转录组,包括编码、非编码和基因间RNA,尽可能完整。然而,在很多情况下,人们的目的只是研究翻译成蛋白的编码转录本。此外,有些研究的目的是分析小RNA,主要是miRNA,或snoRNA、piRNA等。作者列出了各个实验的选择指南。

  作者还提到,制备测序文库时的主要目标是产生尽可能少的偏向(bias)。偏向可被定义为因实验设计而产生的数据系统失真。既然不可能消除所有来院的实验偏向,那么我们至少要了解,偏向发生在哪里,并采取一切可行的步骤来尽量减少;注意实验设计,让不可能消除的偏向对最终分析的影响最小。

  此外,作者还详细介绍了各个NGS应用的样品制备方法,包括靶向测序、mate pair测序、ChIP-Seq、RIP-Seq以及Methylseq,并讨论了从单细胞制备文库的方法。