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【讨论帖】western 内参选择
在western blot 实验中，内参的使用是个很重要的部分，【讨论帖】western 内参选择
看到很多站友对内参的选择 经常有些疑问，鉴于此，希望能在一个帖子里面综合所有相关问题，展开讨论，共同学习。
我先提几个，抛砖引玉，希望大家继续。
1。为什么一定需要内参？内参的重要性。
2。常用的几种内参。
3。不同的情况如何选择不同的内参。
4。。。。。
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ukonptp (2013-4-20 16:14:54)
1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。严格意义上说，内参事必须做的。
2：常用的内参有：b-actin，GAPDH，近2-3 年，更详细的研究发现，β-Tubulin (球管蛋白)， 被广泛应用于Western Blotting，β－Tubolin分子量为55KD左右。
3：一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！
个人一些见解，供参考！
quiqui008 (2013-4-20 16:15:17)
内参的重要性，必要性：
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。
因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。
内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。
然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。
在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。
wood533 (2013-4-20 16:21:04)
我想问一下,内参和目的蛋白相差15kD能不能将膜上他门的位置(用预染)分别剪下来,孵育啊?还是必须得跑两张膜一个内参一个目的蛋白啊?洗膜的时候可以放在一起洗么?如果他们是同源的二抗可以放在一起孵育么?
yueban-1147 (2013-4-20 16:21:29)
回答楼上的问题：完全可以剪开分别加一抗孵育，我就是这么做的；洗膜时最好分开洗涤，放在一起的话两张膜可能重叠在一起，影响洗膜效果；如果不剪膜，你两个一抗来源相同而且特异性很好（单抗）的话，可以一起孵育，不过应该注意可能存在的交叉反应，你可以尝试一下看看结果再定。
dream2013 (2013-4-20 16:21:49)
本人是新手，问一个很汗的问题，原核表达也需要做内参么？做内参的蛋白在哪里找？
不甚感激
avi317 (2013-4-20 16:22:08)
在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：
一、 超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。
常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。我们实验室使用最多的是***工程有限公司与国外实验室合作开发的GAPDH，100μl一支，浓度为100μg/100μl，价格为988元人民币。虽然公司网上称稀释比达1：10000以上，至少可做100次Western mini-blots，但我们一般按照1：5000～6000稀释，不过效果确实非常好，荧光条带非常亮，而且抗体使用3～4次也没太大改变。
我们也使用过博奥森的beta-actin，200ul 480元，稀释比1：200～500。因为稀释比不高，所以价格并不便宜。更可气的是，我PC 12细胞居然有两条条带，小鼠也是两条。
菠萝喵 (2013-4-20 16:22:44)
你 要确保你剪开的部位没有蛋白
菠萝喵 (2013-4-20 16:23:01)
kang chen的HRP－标记内参很好
不需要剪膜 更为直观，有说服力
969 (2013-4-20 16:23:25)
各位高手,我做的是狗的GLUT-4蛋白,很多论文都没用内参,我问了中衫,说没的狗的内参,急死我了,请高手提示在那里能找到?
zranqi_1 (2013-4-20 16:24:08)
我做了半年的western,就我对内参的理解如下
1.所选内参有一下:GAPDH,beta-actin,beta-tubulin等是一些细胞的基本结构蛋白或是管家蛋白,细胞表达稳定,且表达水平高,在同一种类的细胞上表达基本一致.
2.做内参可以:一,检验你的整套western装置是否正常run effectively.包括你的配液,你的胶以及电泳和转移,一抗的效价以及显色等.二检测你的样品蛋白含量是否相等.
3.选择内参要根据你的目的蛋白的性质即你的 目的蛋白是胞内还是核内,你蛋白的 分子量是大是小,当然还有价钱以及你的目的.
4.一般内参是比较容易作出来的,同时它也是帮助你摸索条件的,你把其做漂亮,你后面就很顺利了,只是转移的条件有点变化.其余照样或根据说明书操作.
mamamiya (2013-4-20 16:24:28)
wsll (2013-4-20 16:24:49)
那么，我想请教一下用过β-actin做内参的朋友，有没有遇到过β-actin抗体检测不到小鼠心肌和肌肉组织β-actin的情况？当然前提是：1，我的确提取到了心肌和肌肉组织的总蛋白，且检测到了我的目的条带。2，用此抗体可以检测到其他组织中β-actin条带。
也发现，在碧云天网站上，曾提及“本抗体不能用于成年动物心肌或骨骼肌的免疫染色”。cuturl('http://www.beyotime.com/aa128.htm') 具体什么原因造成这种情况，我也不想太麻烦去搜了，还请知道的战友指教。同时也算是给朋友们提个醒吧。
另，我曾用GAPDH抗体死活也检测不到小鼠肺组织的条带，由于这个做的时间比较早了，不知道是抗体原因还是我WB的原因还是其他原因，不得而知。仅供朋友们一个参考吧。
tuuu2 (2013-4-20 16:25:06)
有个弱弱的问题想请教一下：β－actin与α－tubulin的主要区别是什么，在肌组织与上皮组织间表达是否相同？
hold住 (2013-4-20 16:25:27)
请教一个问题:目的蛋白的一抗和内参的一抗能同时混合孵育PVDF膜吗?两个二抗是否也可以呢?如果可以,需要注意什么问题?谢谢!
quiqui008 (2013-4-20 16:25:58)
QUOTE:
会担心有影响。保险一点，还是分别孵育。
你的目的蛋白 和内参 分子量相差多少呢，如果相差比较大，你可以把2者剪开，分别孵育一抗。
如果分子量太相近了，还是先孵育目的蛋白一抗，重新封闭，再孵育内参一抗。
quiqui008 (2013-4-20 16:26:54)
因为GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的。在实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差需要通过测定每个样品中实际转到膜上的GAPDH的含量来进行校正，所以一般的western实验都需要进行内参设置。具体校正的方法就是将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量。然后才进行样品与样品之间的比较。
quiqui008 (2013-4-20 16:27:29)
GAPDH检测。Western Blotting(检测条带大约在36kDa，稀释比例达10，000倍)、ELISA、亲和纯化、免疫荧光及免疫组化。
10595159.gif
quiqui008 (2013-4-20 16:28:10)
图示:抗GAPDH单抗（Cat＃KC-5G4）检测心脏组织匀浆中的GAPDH水平。A-G分别表示不同实验来源的心脏组织匀浆。抗GAPDH单抗稀释比例为1：10，000，HRP羊抗鼠二抗（Cat＃KC-MM-1302）稀释比例为1：1000。采用SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Kit试剂盒及X胶片曝光显影。
fei1226com (2013-4-20 16:28:47)
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也是新手，不过个人为只要目的蛋白和内参的分子量差距足够大当ECL显色时两条带就不会相互干扰，可以同时孵育，一抗二抗均可同时孵育。因为我们用的都是特异性抗体，混合孵育从技术上是没问题的。也有很多人在这样做，也有很好的结果。
从经济的角度考虑，剪膜、分开孵育，一抗4度过夜，这样一抗可以重复利用有时可重复2-3个月。
guagua (2013-4-20 16:29:28)
【讨论帖】western 内参选择