【求助】PCR目的条带颜色淡，二聚体亮怎么办呀？

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• memory (2016-3-03 15:23:26)

  
  减少引物二聚体的方法
  1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；
  2. 可能模板有问题；
  3. 模板浓度过小，适当加大模板量；
  4. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
  5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；
  6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；
  7. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
  8. 增加循环数；
  9. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；
  10. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。
  11. 以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍
  PCR目的条带颜色淡:
  为提高pcr产量，可尝试改善条件。
  1 主要试着降低退火温度可提高pcr产量,以不产生非特异性调带为好.eg:52，5，53，54，55，56，57
  2 提高Mg浓度（mM）可提高pcr产量,以不产生非特异性调带为好.eg：1.5，2.0，2.5，3,0。
  3 增加模板量可提高pcr产量.
  4 增加循环次数,eg:40cycler.
  5 取原先PCR产物作为模板进行二次PCR.
  6 换高效Taq酶.
  祝:实验顺利!

• jkobn (2016-3-03 15:23:48)

  简要地说，你的问题主要是：反转录效果不好，因为内参颜色就很淡嘛，这个是你目的条带很淡的主要原因。可以增加5-10个循环，或者用原来的PCR产物二次扩增，如果效果不好，考虑重新反转录。二聚体，主要是由于cDNA浓度过低，引物相对过多引起的，增加循环数比较好，也有可能是引物不特异产生的，可以换引物或者提高退火温度试试

• zhenxin (2016-3-03 15:24:11)

  减少引物二聚体的方法
  1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；
  2. 可能模板有问题；
  3. 模板浓度过小，适当加大模板量；
  4. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
  5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；
  6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；
  7. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
  8. 增加循环数；
  9. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；
  10. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。
  11. 以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍
  PCR目的条带颜色淡:
  为提高pcr产量，可尝试改善条件。
  1 主要试着降低退火温度可提高pcr产量,以不产生非特异性调带为好.eg:52，5，53，54，55，56，57
  2 提高Mg浓度（mM）可提高pcr产量,以不产生非特异性调带为好.eg：1.5，2.0，2.5，3,0。
  3 增加模板量可提高pcr产量.
  4 增加循环次数,eg:40cycler.
  5 取原先PCR产物作为模板进行二次PCR.
  6 换高效Taq酶.
  祝:实验顺利!

• caihong (2016-3-03 15:24:31)

  谢谢楼上的。最近我加大模板量为2UL，却连目的基因的影子也不见了。后来又改回1UL。昨天和今天又做了几个模板，都加的1UL，内参颜色很淡，目的基因几乎看不到。不知道是什么原因，是不是模板有问题了。这几个模板测得的MRNA的OD值都在1.8-2.0之间,但是这几个模板逆转录时99度水浴时间>5分钟(说明书是要求5分钟)。而我以前的模板按照同样条件都能看到目的基因条带的。不知是不是这个原因了。

• mogu (2016-3-03 15:25:03)

  模板的问题:
  不知道你提取的总RNA跑过电泳没有,如果没有,我觉得OD值的结果未必能真实反映RNA的质量,而这是最关键的,反转录时的试剂盒按标准操作估计问题不大,冰上操作,其中一些加温步逐后建议在冰上至少放置一分钟.效果可能更好.
  引物特异性:
  如果有其他的引物,可以试试换一对引物,引物本身花费不多,但是花费的时间和相应的试剂耗材就太不值得了

• caihong (2016-3-03 15:25:41)

  
  我今天重新抽提RNA和逆转录获得CDNA，提取RAN和逆转录的过程都很顺利。然后按照前面的反应条件进行PCR扩增，目的基因条带还是没有，而内参很清晰。这应该可以排除模板和试剂降解的因素。但到底是什么原因呢？难道是目的基因引物因反复冻溶降解了？那为什么内参引物没降解了？实在是捉摸不透。

• wawa (2016-3-03 15:25:58)

  
  楼上所说的:5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；
  这点我看行不通吧?上下游引物可以混合在一起吗?

• caihong (2016-3-03 15:26:17)

  
  我的退火温度是根据引物TM值设定的，并且用这个温度和同样的条件跑出过清晰的目的基因和内参条带，只是后来不知为什么就跑不出来了。

• eor (2016-3-03 15:26:50)

  
  1. 主要还是考虑你的目的基因引物是否有问题,可以重新合成.
  2.不好意思说,你要考虑加样时是否操作正确.
  3.楼上弦子" 这点我看行不通吧?上下游引物可以混合在一起吗? "
  为什么不能混呢,本来体系都要混在一起的.

• caihong (2016-3-03 15:27:14)

  我今天重新开了一瓶引物，重新溶解的，应该不会有问题。我怀疑是taq酶降解了。内参在一般组织中较容易表达，而目的基因则较难表达。

• superboy (2016-3-03 15:27:31)

  我遇到类似的问题，但也不知道如何处理，我自己思考是引物的问题或是我的操作手法问题

• hulu呼噜 (2016-3-03 15:37:44)

  
  不要大于5分钟,会断裂的.

• caihong (2016-3-03 15:38:47)

  我昨天又用同样的模板ＤＮＡ做了一次ＰＣＲ，其中Ｔaq酶增加为０.25ul,Mgcl2+增加为4ul,模板ＤＮＡ增加为1.5ul,总体系为25ul,其余条件不变，竟然跑出了目的基因条带，只是颜色较淡。所以试剂经常冻融至活性降低可能是前段时间跑不出目的基因条带的原因。

• DDD (2016-3-03 15:47:33)

  QUOTE:

  原帖由 caihong 于 2016-3-3 15:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我昨天又用同样的模板ＤＮＡ做了一次ＰＣＲ，其中Ｔaq酶增加为０.25ul,Mgcl2+增加为4ul,模板ＤＮＡ增加为1.5ul,总体系为25ul,其余条件不变，竟然跑出了目的基因条带，只是颜色较淡。所以试剂经常冻融至活性降低可能是前段时间跑不出目的基因条带 ...

  你好，我现在也遇到同样的问题，能跑出内参和目的条带，内参很亮，但目的条带却很暗，请问这个问题应该怎么解决呢？

• 987789 (2016-3-03 15:47:54)

  QUOTE:

  原帖由 caihong 于 2016-3-3 15:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我昨天又用同样的模板ＤＮＡ做了一次ＰＣＲ，其中Ｔaq酶增加为０.25ul,Mgcl2+增加为4ul,模板ＤＮＡ增加为1.5ul,总体系为25ul,其余条件不变，竟然跑出了目的基因条带，只是颜色较淡。所以试剂经常冻融至活性降低可能是前段时间跑不出目的基因条带 ...

  我也存在同样的问题，我增加过退火温度，增加过模板量，但多少还是存在二聚体，二聚体总是比目的条带量！你能给我什么建议吗