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厦大特聘教授：如何优化乳化PCR

2012.11.01

　　仅仅不到三十年的时间，聚合酶链式反应PCR席卷了生命科学研究，成为了许多生物实验室必备的实验技术。虽然其基本前提――扩增目的DNA样品――不变，但近年来出现了不少创新，将这一技术发展到了许多应用领域，比如利用定量PCR分析特异性RNA转录的拷贝数，来确定基因表达水平。另外基因组研究的发展也促使研究人员增多了PCR的应用，比如缩小重点，遗传信息分析缩小到单个分子或细胞，比如扩大撒网，增加单次试验中的反应次数。

　　为了达到这些目的，研究人员采用了一种在乳化溶液中进行的高通量PCR技术，这种被称为乳化PCR(emulsion PCR，ePCR)的方法主要通过将水相PCR溶液(包含有引物，聚合酶，核苷酸和待扩增DNA)与油混合，创建一种微小的悬浮水滴乳液。每个液滴都作为其自身PCR的“反应器”，从而创造了平行反应中的多个独立反应。

　　厦门大学特聘教授杨朝勇博士致力于这方面的研究，他表示，这些液滴常常往往只有几皮升的体积，能最大化聚合酶试剂比，减少大体积PCR反应中造成的浪费，大幅度提高工作效率。

　　目前市面上的很多数字PCR仪器能进行这种实验，其优点之一在于这样大量的独立反应能令产物只见到交叉污染缩小到最少，并且更重要的是，乳化PCR方法能将单调乏味的实验进化成高通量的扩大实验。

　　不过这种方法也存在缺陷，据奥地利约翰开普勒林茨大学基因组重组研究人员Irene Tiemann-Boege称，对于希望能进行全基因组仔细分析的研究人员来说，这种ePCR方法“产物长度很短，利用标准的PCR方法，能扩增 1-2kb”，而利用这种方法，“最长也只有150bp”。商业性的ePCR也存在所需反应量要大于一皮升的情况，因此正如加州大学伯克利分校的 Richard Novak所说的那样，科学家们还在寻找更好的解决方法。

　　优化适体

　　适体(aptamer，也称为适配分子)是通过体外SELEX技术从寡核苷酸随机库中筛选出来的，与目标分子具有高度的结合特异性的寡核苷酸序列，设计适体常常是个费力不讨好的工作，要从大量可能的序列中找到适体相当耗时，这需要将候选适体序列克隆到质粒中，然后培养细菌，从中筛选适体分析的克隆。这些候选适体都需要进行测序――这一步不便宜，然后还需要进行序列比对，找到结合的好的适体，最后，研究人员还要单独分析每个适体的结合情况，这些无疑都要花费大量人力物力和财力。

　　来自厦门大学的杨朝勇教授希望能简化这个过程，只对优质的适体进行测序，他表示，希望能避免由于利用微珠分离分子造成离散反应的这一问题，“在(数字PCR仪器)微米通道中运转微米大小的微珠，会造成拥堵”，他说，因为微珠在通过通道时会相互挤压，“运转会非常慢。”

　　为了解决这个问题，杨朝勇教授研究组抛弃了微珠的方法，采用了基于琼脂糖的PCR。杨教授解释道，琼脂糖液滴本身能像微珠一样工作，通过调整温度就能操纵琼脂糖由湿软性质变成固体，再逆转回去，因此，琼脂糖的液滴可以方便PCR反应，也可以作为固体排列的微珠。就是利用琼脂糖凝胶，杨教授研究组能简单使得微珠很容易地，在超常速度下通过数字PCR仪器通道。

　　杨教授将适体分子与PCR试剂包装在一起，琼脂糖的多孔性能令类似溴化乙锭或SYBR Green的小分子扩散，从而能荧光标记扩增适体，然后研究人员就检测标记的琼脂糖珠的结合亲和度，筛选合适的适体进行测序(Anal Chem, 84:350-355, 2012)。

　　琼脂糖珠也易于操纵，“您可以使用镊子转移(PCR)产物，如果是乳液，你怎么能拿得起呢?”

　　作者简介：

　　杨朝勇

　　1975年生，厦门大学特聘教授，固体表面物理化学国家重点实验室固定成员，博士生导师。1994年进入厦门大学化学系国家人才基地班学习;1998获得理学学士并保送研究生;2001年获理学硕士后赴美佛罗里达大学(University of Florida)化学系攻读博士学位，于2006年获博士学位。2006-2007年在美国加州大学伯克利分校从事博士后研究。2008年任厦门大学化学系教授。

　　研究方向：

　　包括分子探针的设计与合成、单细胞研究、纳米生物医学工程、特异性生物分子作用研究和微流控技术在生物医学中的应用。多年来以解决生命科学中如疾病早期诊断、人脑学习记忆机制的破译等一系列重要问题为目标，从事单细胞水平的基因表达分析研究，先后在PNAS, J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem., NAR, Nano Lett.,Lab Chip等国际顶级学术刊物发表论文40多篇，被引用1000多次。申请国际ZL4项。

　　获奖情况：

　　先后获得了美国化学会分析化学研究生奖、美国Sigma　Xi科研协会研究生奖，中国政府国家优秀自费留学生奖。

基因组琼脂糖厦门大学研究生

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