【求助】急请各位高手分析下我的2DE图为什么上半部分...

最新回复

• zhihui小新 (2014-3-01 16:43:22)

  
  下面这张是和上面那张同时跑的胶，酸性端一大片糊糊的。两个样本分别是我的实验组和对照组，都是采用同样的处理方法，上样量都是230微克，聚焦参数参考BIORAD的方法。为什么差异这么大呢？非常希望得到各位的分析和指导。谢谢

  
  72343616.snap.jpg

• yjf1026 (2014-3-01 16:43:58)

  
  以前我也遇到过这种情况，有两种可能的原因，1，电泳缓冲液ph值是不是达到要求，最好是新配的，2染色温度的原因。不知道你的二向是不是跑的sdspage还是tricinesdspoage?

• jujuba (2014-3-01 16:44:44)

  我觉得有可能是核酸的问题。不知道样品有没有经过超声处理，可以试一下。血液污染应该与这个无关，我做的组织混有很多血液，不会出现这种情况

• zhihui小新 (2014-3-01 16:45:25)

  .我的二向跑的是SDS-PAGE,染色方法用的是银染,和实验室的其它同事用的是相同的电泳缓冲液的染色温度,他们却没有遇到这种问题.楼上提到的超声是用超声细胞破碎仪吗?我没有用,不知道eyedrop用的超声强度是多大，匀多久呢？

• zhihui小新 (2014-3-01 16:46:34)

  
  另外，你们觉得有必要使用DNAse1 和 RNAse A吗？

• zhihui小新 (2014-3-01 16:47:10)

  
  我用的胶条是17cm的，请问DIGE如果用100－150G的上样量，点会不会很浅。另外，你在用TCA-丙酮纯化蛋白的时候，会不会遇到沉淀难溶的情况呢？

• wood533 (2014-3-01 16:48:31)

  我想请问一下，用超声的方法去除核酸，具体的步骤应该是怎样的呢？

• huifeng0516 (2014-3-01 16:49:30)

  我用的胶条是17cm的，请问DIGE如果用100－150G的上样量，点会不会很浅。另外，你在用TCA-丙酮纯化蛋白的时候，会不会遇到沉淀难溶的情况呢？
  
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  刚开始做时，我也是200ug上样，银染后，点虽多，但背景太高，没法分析。
  丙酮纯化后确实有难溶的现象。而且跑的图谱不太好.
  后来我用了GE的clean up试剂盒，同时我用的是80ug上样，结果还可以。
  给你贴一张我的2DE图，供参考。

  
  61242340.snap.jpg

• zhihui小新 (2014-3-01 16:50:28)

  我想再请教您，您的前后两张图除了使用CLEAN UP KIT以外，聚焦参数等条件有改变吗？我一向聚焦的时候总伏时数大约10万，会不会太多了啊？以至横纹特别明显。我觉得你的第二张图的横纹现象改善的很好，想请教您是怎么改进的。
  我没有用过CLEAN UP KIT，在这里问个弱弱的问题，就是CLEAN UP KIT的主要作用不是针对除盐吗？它为什么对去背景效果也这么好呢？

• ha111 (2014-3-01 16:51:18)

  
  我用的超声程序是80w，处理8s，间隔16s，共4次，处理时严格冰上操作。在减轻背景颜色方面确实有作用。不过处理时会出现很多气泡，当时很害怕蛋白会降解，不过后来胶跑出来还可以。
  另外，我觉得如果点偏少，适当增加上样量也是可以的。我们用24cm的胶条，上样350ug，点明显比上样250ug多，且只要控制银染的显色时间，背景和横文都能够控制。

• hot_hot_hot (2014-3-01 16:52:29)

  您的前后两张图除了使用CLEAN UP KIT以外，聚焦参数等条件有改变吗？我一向聚焦的时候总伏时数大约10万，会不会太多了啊？以至横纹特别明显。我觉得你的第二张图的横纹现象改善的很好，想请教您是怎么改进的。
  我没有用过CLEAN UP KIT，在这里问个弱弱的问题，就是CLEAN UP KIT的主要作用不是针对除盐吗？它为什么对去背景效果也这么好呢？
  
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  我没有用过CLEAN UP KIT，在这里问个弱弱的问题，就是CLEAN UP KIT的主要作用不是针对除盐吗？它为什么对去背景效果也这么好呢？
  两个图的聚焦参数一样，总伏小时数为7万，对于17cm的胶条，10万确实有点高了。
  我用的聚焦参数如下
  Step1 50V 12hrs
  Step2 200V 1hr
  Step3 500V 1hr
  Step4 1000v 1hr
  Grad5 8000V 1hr
  Step6 8000V 60000VHr
  此外，对于碱性端横纹，我还加了Destreak Reagent（GE的）。GE的技术支持说，该试剂可替换DTT，但我尝试后发现，DTT和Destreak同时加效果最好。
  Clean up Kit的效果确实不错，可用于除盐、脂质、核酸、及植物样品中的酚类等。
  但得到一张好的2DE胶，蛋白样品的质量决定一切。由于刚开始做时，提蛋白的方法优化的不够好，导致蛋白的质量不高，有很多杂质的干扰。因此需要Clean up Kit对样品进行纯化。现在，不用clean up处理，也可达到这个效果了。
  因此，你可先从减少上样量、超声除核酸这两步开始改进试试。

• hot_hot_hot (2014-3-01 16:52:54)

  我想请问一下，用超声的方法去除核酸，具体的步骤应该是怎样的呢？
  
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  The sample was sonicated 4 times at 100 w for 6 s with intervals of 30 s and centrifuged for 1 h at 25,000×g. All steps were carried out at 4℃.

• #问号# (2014-3-01 16:53:52)

  
  还想请问DIGE一个弱弱的问题，超声去核酸，离心后，核酸是在pellet 里还是在supernate里？

• zhihui小新 (2014-3-01 16:55:10)

  谢谢上面各位老师给与的指导。我刚刚又处理了一个角膜样本，匀浆后用超声120W超5次，间隔16秒后发现仍有一团很粘的东西，我用枪吸的时候会把它吸上来，就在枪头口那里堵着，我加大超声强度到300W，又继续超了5次，还是不能把它打碎，不知道该怎么处理它？急请各位老师的帮助，谢谢

• hot_hot_hot (2014-3-01 16:55:38)

  还想请问DIGE一个弱弱的问题，超声去核酸，离心后，核酸是在pellet 里还是在supernate里？
  
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  25000 g 离心后，取上清为蛋白，进行定量。

• hot_hot_hot (2014-3-01 16:56:24)

  我刚刚又处理了一个角膜样本，匀浆后用超声120W超5次，间隔16秒后发现仍有一团很粘的东西，我用枪吸的时候会把它吸上来，就在枪头口那里堵着，我加大超声强度到300W，又继续超了5次，还是不能把它打碎，不知道该怎么处理它？
  
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  粘粘的很可能是核酸，但也可能是你角膜组织的特殊成分。用1000或1500 g 离心后取上清应该就行了。

• lxh031 (2014-3-01 16:57:15)

  上样量大了点,染色时间过长,血液污染有影响
  我做的样品用DNAse1处理后,粘稠的东西少了很多

• zhihui小新 (2014-3-01 16:57:48)

  用核酶处理的时候是在哪步用呢？我处理时一般是把裂解液加到样本中去，如果再加核酶，那核酶不是会被我的裂解液变性而失去酶解作用吗？

• glass (2014-3-01 16:59:02)

  估计是角膜中的糖蛋白,你减少上样量.那东西很烦人,不染就用糖甘酶处理.

• glass (2014-3-01 16:59:19)

  
  类似唾液中的糖蛋白