【讨论帖】western blotting试验技术讨论

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• ukonptp (2013-5-13 18:06:49)

  
  我先来谈谈Western blotting 试验原理吧，算是抛砖引玉哦！！
  
  蛋白免疫印迹（Western blotting、Western blot 或Immunoblotting）是先将组织样品通过电泳使不同分子量的蛋白质跑到一个横断面上，然后将蛋白质转移到膜上，再通过膜上蛋白抗原与一抗、标记二抗反应，最后用化学发光法检测，再用X胶片显影，拍照后量化，从而间接反映组织中蛋白含量。与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛地应用于定量检测蛋白的表达水平。
  
  简单技术路线流程：
  
  组织样品制备——垂直电泳——转膜（和丽春红染色）——牛奶封闭——一抗孵育——二抗孵育——ECL化学发光——X胶片显影——拍照和用图像分析染件定量。

• ukonptp (2013-5-13 18:08:44)

  
  试剂准备：
  
  1、组织样品制备：RIPA裂解液、PMSF;
  
  2、灌胶：去离子水（可用三蒸水代替）、Acr/Bis、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%SDS、10%Ap和TEMED；
  
  3、垂直电泳：4度电泳缓冲液、冰块、考马斯亮蓝及其洗脱液；
  
  4、转膜：4度转移缓冲液、冰块、去离子水、自来水、丽春红染液、考马斯亮蓝及其洗脱液；
  
  5、封闭：5%脱脂牛奶、DPBS；
  
  6、抗体反应：一抗、二抗、抗体稀释液、5%脱脂牛奶、DPBS和PBST；
  
  7、化学发光：ECL发光剂（A液和B液，分pg和fg级）；
  
  8、X胶片显影：显影液、定影液、自来水。

• ukonptp (2013-5-13 18:10:53)

  
  欢迎大家就Western blotting试验技术操作流程、注意事项、常见问题及其解答进行热烈交流，谢谢。

• mimili_901 (2013-5-13 18:11:28)

  
  关于灌胶：
  1．注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
  
  2．分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。
  
  3．封胶：
  灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。
  待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。
  
  4．灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
  
  ps: 10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉。

• finger (2013-5-13 18:12:12)

  
  我刚做不久，有一下几点体会：
  1.根据目的蛋白分子量选择合适的实验条件：如分离胶的浓度，转膜的电压设置
  2.抗体的优化：如果实验室没人用过，则新买的抗体一般要做预实验，摸索一下合适的稀释浓度
  3.显影时曝光时间，由于对样品中目的蛋白浓度不是很清楚，为得到好的效果，一般需要做几个时间的片子，我们采用是2-3张底片叠一起曝光，最上面的底片就相当于曝光时间短。
  4.封闭：一般用脱脂牛奶，但有人说抗羊抗体的话用FBS比较好
  5.抗体分装，避免反复冻融
  6.信号灵敏度：一抗可4度过夜，二抗则要2h即可。
  大家指正

• fei1226com (2013-5-13 18:12:33)

  做了1个多月的WB，有几点体会：
  1.玻璃板用两个星期左右可以泡次酸，这样很容易洗干净；
  2.浓缩胶一定要等1小时左右再拔梳子，特别是现在天冷，凝得慢，急不得；
  3.AP配置分装后-20度冻存，两周内使用都有效；
  4.TEMED不是越高越好，提高用量胶是凝得快，但是胶很脆，易碎；
  5..丽春红染色并不是金标准，有时候做小分子量的蛋白用丽春红染膜就不太明显，这时不要认为失败了，继续做下去，同样会有结果；
  6.NC膜不用泡甲醇，泡甲醇的NC膜会出现皱缩的现象；（自己误操作）
  7.一抗37度过夜也能出条带，且有非特异性的条带出现；这个现象自己不清楚原因，此后都是按照标准的4度过夜。思考，如果说在37度的条件下抗体更容易结合，那么孵一抗的时间可以适当缩短。
  8.用脱脂奶粉的封闭液一定要现用现配。
  大家多多交流

• kuaizige (2013-5-13 18:12:50)

  
  关于显示：个人认为用碱性磷酸酶系统显示更直观，更好控制，更简单方便。

• 987789 (2013-5-13 18:13:19)

  
  那我就谈谈试验中要注意的一些问题
  
  一、样品的处理
  1、若蛋白需保持活性，那么全部操作需在冰上进行，并且在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解。
  2、如果需要检测磷酸化的蛋白，那么裂解液中必须加入磷酸酶抑制剂。
  3、样本定量时注意选择受buffer成分影响的方法，或者尽量降低溶剂成分对定量结果的干扰，以保证蛋白定量的准确。
  4、样本如果需长期保存，可以放于-80度冰箱中，切记反复冻融。
  5、样本上样需适宜，过少会检测不到所需要的蛋白，过多可能导致背景升高。

• 987789 (2013-5-13 18:14:16)

  二、蛋白分离
  1、分离胶不要倒得太满，需要有一定浓缩胶的空间，否则起不到浓缩效果。
  2、PAGE胶在0.5-1h内凝聚最好，过快表示TEMED、APS用量过多，胶太硬易龟裂；太慢则说明两种试剂用量不够或系统试剂不纯或者失效。
  3、混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，太慢不均匀，都能导致电泳带畸形。

• 987789 (2013-5-13 18:15:05)

  
  三、转膜
  1、膜的选择 从结合蛋白的能力上看，PVDF膜（100-200微克/平方厘米）比硝酸纤维素膜（80-100微克/平方厘米）高；就物理强度而言，硝酸纤维素膜较脆，易破碎，而PVDF膜韧性较强；但是硝酸纤维素膜的背景较PVDF膜要低。另外，对于小分子量的蛋白（小于20kDa）一般用0.2微米孔径的膜，而大分子量的蛋白一般用0.45微米孔径的膜。
  2、戴上手套接触油纸、凝胶和膜，因为手上有油脂会阻断转移。
  3、排去滤纸、胶和膜之间的气泡，因为气泡会产生短路。
  4、转移后效果的鉴定：染胶：考马斯亮蓝检测极限可达1.5微克
  染膜：一般采用丽春红，染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步分析。

• 987789 (2013-5-13 18:15:29)

  
  四、封闭和杂交
  1、常见的封闭液有BSA和脱脂奶粉，脱脂奶粉的封闭能力比较强，一般我们采用5%的脱脂奶粉溶于TBST中作为封闭液。
  2、一抗与二抗我们用5%的BSA或TBST进行稀释；一抗我建议4度过夜，这样抗原抗体结合更充分。
  3、0.1%Tween-20溶于TBS中配成洗涤液，在一抗与二抗结合完毕后洗膜三次，减少由于抗体粘附而引起的非特异性显色。

• 喇叭花 (2013-5-14 12:29:03)

  我做了半年的western blotting，从一个新手到基本完成western blotting试验，也谈一些个人的经验，仅供同学们参考学习：
  1：灌胶：现在到冬天了，气温低，胶不容易凝，可开启空调 提高室温，或则加大TEMED的量。
  2：玻璃板第一次用可以泡酸过夜，以后就用洗衣粉洗干净即可 然后在烘箱里烤干 就可以灌胶了
  3：加样的时候 ，未加样的孔加SDS上样缓冲液，避免边缘效应
  4：一抗稀释液我用的是0.5%BSA，用TBS稀释，二抗稀释液用的是3%脱脂奶粉 效果不错
  5：膜接触了金属(比如镊子等)，容易导致荧光淬灭，和膜接触的东西最好保持干净 比如保鲜膜，曝光夹等

• standbyme (2013-5-14 12:29:34)

  
  做了三个月的western blot，有些心得想和大家一起分享。
  1、组织蛋白提取
  组织蛋白提取方面得明确自己所要提的蛋白定位在细胞的哪个位置，胞浆、细胞膜、细胞核，不同位置的蛋白提取方法是不一样的。本人检测的指标是大鼠肾脏组织核蛋白，刚开始直接采用碧云天裂解液P0013B来提取蛋白质，说明书介绍说裂解核蛋白能力相当强，就按照说明书提蛋白的步骤提取总蛋白，可是提取的总蛋白经电泳后发现蛋白在浓缩胶压缩的很不理想，估计是直接提取肾脏组织总蛋白浓度太高的原因（BCA定量显示 180000ug/ml），因而不合适，后来采用专门的核蛋白裂解液配方才成功提取了核蛋白。因此，我觉得碧云天的裂解液并不是万金油，还是得根据具体情况选择最佳的蛋白提取液。
  2、灌胶
  首先一定要将玻璃板清洗干净。早晨清洗玻璃板时，可用洗洁精或者洗衣粉等清洗玻璃板，然后在60℃的烤箱里把水分烤干。烤干的玻璃板再装上，一般就不会漏。检测是否会漏胶我是先灌蒸馏水，5min内若蒸馏水的液面不下降或者只降低一点点那就不影响灌胶了，可放心配胶。分离胶加的量不可太多，否则上样泳道就过浅，减少了上样量。分离胶的聚合时间最好保证有40min的聚合时间，虽然多加了过硫酸铵和TEMED的话可以加快聚合速度，但是我不推荐。认真做好一块胶是做好后续实验的基础。
  3、电泳
  从历届师兄以及个人实验，我觉得蛋白样品在浓缩胶时的电压为80V，时间为20min左右，在分离胶时可以提升到110V，直至溴酚蓝将抛出为止，整个电泳时间大概在120min左右，当然分离胶浓度不同的话时间会有所差别。
  4、转膜
  多次的实验摸索让我对转膜颇有心得。有条件的话最好用新鲜配制的转移缓冲液，最好不要超过三次，否则缓冲液的成分发生改变，你用同样的转膜条件就不一定能有一样好的转膜效果了。个人觉得似乎恒压转膜要强于恒流转膜，虽然有人说采用恒压转膜可能会因为甲醇的挥发导致电流不平稳，不利于转膜，但我采用恒压效果还是相当不错的。
  5、封闭
  我们实验室采用10%的脱脂奶粉封闭，时间一般为2~3h，但是我是封闭过夜，效果不错，背景淡，特异条带突出。当然这跟一抗、二抗的稀释度也是有关系的。背景很深的园友可以考虑4℃封闭过夜。
  6、一抗
  刚开始一抗稀释度的摸索可以按说明书上限的两倍来摸索，比如说明书说1：100~1：500，我们可以从1：1000来摸索，我的指标就是这样子，其他人也很多这种情况，好的结果一抗的稀释度不一定在说明书的稀释范围。
  一抗的孵育时间最好是室温摇床2h后再放入4℃冰箱过夜，利于抗原抗体结合。
  7、二抗
  二抗的孵育时间为1.5h~3h，不想等的话1.5h就够了，一般是2h
  8、漂洗
  用TBST漂洗PVDF膜 15min*3次 TBST最好两天换一次，放置过久，吐温失效。
  9、曝光
  在暗室里曝光时若能看到目的蛋白的荧光条带最好不过，若是不能看到也不要气馁，可以压片10min，再看看曝光效果。另外胶片从显影液取出放置定影液之前时 先过一下水 可以延长定影液的使用时间。我观察到用久了的定影液定影时间显著长于新配的定影液，若你发现定影得花上2min时间时，说明你的显影液定影液都得换了。。。。
  不足之处， 请其他战友多多补充，一起交流。。。。

• hold住 (2013-5-14 12:29:56)

  
  把WB的步骤和注意事项贴出来吧，供大家参考：
  1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
  1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
  2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
  3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
  4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
  5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
  6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
  2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
  3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
  4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
  5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
  6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
  7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。
  8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）
  9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。
  10. 将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。
  11．按步骤9洗涤。
  12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS），于室温下摇动。

• flower-201 (2013-5-14 12:30:21)

  
  现在天气冷，我们做胶曾经1.5个小时都不凝，后来将胶加水封后放入37度隔水式培养箱，很快就凝了（约25分钟），而且胶的质量也不错，经实验证实没有差别。
  需要注意的是放入培养箱内动作要轻，且保持水平，否则做出来的胶是斜的且后面加浓缩胶后交界线不平整。

• 3N4G (2013-5-14 12:30:47)

  我是新手，发现显影之后有些带有点朦胧不清晰，而且有时候带呈现弯曲状态，有的好像连跑胶的时候的泳道也显出来了，这是什么原因呢？

• 3N4G (2013-5-14 12:36:45)

  
  MARKER显出来是怎么回事呢?

• orangecake (2013-5-14 12:37:27)

  现在天气冷，我们做胶曾经1.5个小时都不凝，后来将胶加水封后放入37度隔水式培养箱，很快就凝了（约25分钟），而且胶的质量也不错，经实验证实没有差别。
  需要注意的是放入培养箱内动作要轻，且保持水平，否则做出来的胶是斜的且后面加浓缩胶后交界线不平整。
  
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  请问你的胶中AP浓度是多少？通过增加AP的量可以促进胶凝固，但不能太大否则很快凝固。我们分离胶一般10ml胶中加10%AP为80-100ul即可；而浓缩胶一般6ml中加10%AP为60ul左右即可。

• 天蝎座 (2013-5-14 12:37:47)

  
  我是新手，我来谈谈我的经验和教训：
  1，膜一定要标好蛋白面，否则实验多了，特别是膜放久了，stripping后重新做时容易搞不清蛋白面。我一般常规在蛋白面朝下的左上角上剪缺。
  2，电泳时间：浓缩胶时的电压为100V，时间为20min左右，在分离胶时可以提升到200V，直至溴酚蓝将跑出止，或者目的条带到板子下三分之一就可以了。整个电泳时间大概在60min左右，当然分离胶浓度不同的话时间会有所差别。
  3，转膜建议湿转，较半干转效率高，而且不容易转过。

• zzzz (2013-5-14 12:38:12)

  
  是啊 western blotting 追常用了