【求助】western blot奇怪的现象！

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-5-28 16:25 作者: 扫雷军kuzi 来源: 分析测试百科网

本人本人取小鼠肝脏组织，的总蛋白后做最近做western 有一奇怪现象！
1.作出来的目的条带都很好（86kd），但是内参actin很模糊，杂带多而且个别样本根本没有actin条带，
2.于是换用了 GAPDH ，结果却很好！！
3。于是又换用了别人使用过的能作出来的 actin内参以及相应的二抗，我做了一遍结果还是模糊杂带多，个别样本没有内参的条带！

请教各位高手，解惑！～！百思不得其解！！

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【求助】western blot奇怪的现象！

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最新回复

8princess8 (2013-5-28 16:27:05)

无论怎么复杂，本质无非两种情况，一是抗原有问题，二是抗体有问题。
对于抗原：
1、转膜时问题；
2、蛋白被降解
3、样品处理过程中蛋白丢失
4、样品中量很少，所用的抗体无法达到足够的检测灵敏度
5、样品处理液的问题，抑制了抗体活性，或者竞争性结合了抗体
验证办法：取一株细胞，裂解后用你的同样WB条件，包括一抗和二抗去validate抗原的存在与否。如果用细胞的裂解液能够做出完美的结果，那么就是抗原的问题了。可以从以上4个方面去分析，包括重新杀小鼠取肝脏。

抗体问题：
1、抗体储藏时间过长，已经失去了活性
2、抗体质量很差，特异性很低
3、一抗稀释度和不合适
4、二抗的稀释度
5、封闭液的可能问题

你所说的“换用了别人使用过的能作出来的 actin内参以及相应的二抗”，我猜测是用你自己的抗原，用别人的一抗和二抗，也没有做出来。你这种做法，还是没有办法排除故障。

鉴于beta-actin是个常见的WB内参蛋白，我个人认为很有可能是样品的处理问题。
可参考此文： cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2742551/')
wood533 (2013-5-28 16:28:05)

这个现象最可能的问题是你的actin的二抗，因为老鼠来源的二抗是针对老鼠的IgG，而在肝脏组织中有大量血液，所以你的sample里面肯定含有大量的IgG，而且IgG有两条band，并且结合特异性肯定比actin强，所以你用鼠源二抗出现非特异性条带可能性很大，而且由于结合特异性不如IgG，所以造成actin显示不清楚，建议换成rabbit来源的二抗试试。
ukonptp (2013-5-28 16:37:18)

根据你说的情况，抗体应该没问题，GAPDH能做出来，说明蛋白提取也没有问题，有可能是转膜条件没有控制好，actin 42KD，会不会是转膜时间太长了。
yjf1026 (2013-5-28 16:38:33)

肝细胞里beta-Actin的表达量只有平均值的三分之一，内参不清楚是正常的。其实你换GADPH就能做出来也证明了你的操作没有问题
扫雷军kuzi (2013-5-28 16:40:49)

肝细胞里beta-Actin的表达量只有平均值的三分之一，内参不清楚是正常的。其实你换GADPH就能做出来也证明了你的操作没有问题

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谢谢你！！换GADPH就能做出来，而且目的条带都能作出来了，我认为这充分也证明了我的整个操作没有问题；百思不得解？？β－actin 为何会这样结果？？是否再肝脏肺脏肾脏中 actin 含量少？？不合适作内参？？
扫雷军kuzi (2013-5-28 16:42:43)

无论怎么复杂，本质无非两种情况，一是抗原有问题，二是抗体有问题。
对于抗原：
1、转膜时问题；
2、蛋白被降解
3、样品处理过程中蛋白丢失
4、样品中量很少，所用的抗体无法达到足够的检测灵敏度
5、样品处理液的问题，抑制了抗体活性，或者竞争性结合了抗体
验证办法：取一株细胞，裂解后用你的同样WB条件，包括一抗和二抗去validate抗原的存在与否。如果用细胞的裂解液能够做出完美的结果，那么就是抗原的问题了。可以从以上4个方面去分析，包括重新杀小鼠取肝脏。

抗体问题：
1、抗体储藏时间过长，已经失去了活性
2、抗体质量很差，特异性很低
3、一抗稀释度和不合适
4、二抗的稀释度
5、封闭液的可能问题

你所说的“换用了别人使用过的能作出来的 actin内参以及相应的二抗”，我猜测是用你自己的抗原，用别人的一抗和二抗，也没有做出来。你这种做法，还是没有办法排除故障。

鉴于beta-actin是个常见的WB内参蛋白，我个人认为很有可能是样品的处理问题。
可参考此文： cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2742551/')

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谢谢你的解答！！但是我的目的条带都有 GAPDH 也有，很难解释个别样本 actin却没有而且杂带很多
扫雷军kuzi (2013-5-28 16:43:04)

这个现象最可能的问题是你的actin的二抗，因为老鼠来源的二抗是针对老鼠的IgG，而在肝脏组织中有大量血液，所以你的sample里面肯定含有大量的IgG，而且IgG有两条band，并且结合特异性肯定比actin强，所以你用鼠源二抗出现非特异性条带可能性很大，而且由于结合特异性不如IgG，所以造成actin显示不清楚，建议换成rabbit来源的二抗试试。

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十分感谢！！我的actin是小鼠的二抗，是否有必要换成rabbit来源的二抗试试？？
33号 (2013-5-28 16:44:37)

谢谢你！！换GADPH就能做出来，而且目的条带都能作出来了，我认为这充分也证明了我的整个操作没有问题；百思不得解？？β－actin 为何会这样结果？？是否再肝脏肺脏肾脏中 actin 含量少？？不合适作内参？？

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ACTB在平滑肌和白细胞这些经常需要改变形态的组织里表达量很高，肺，肠等经常受到拉伸的组织也有表达，但是内脏的软组织表达量则很低。既然用GADPH能做出来就不用纠结了。

89764242.png
987789 (2013-5-28 16:46:10)

遇到过这种情况，你提取蛋白时候是否按照程序？？actin在内脏的软组织表达量较低。既然用GADPH能做出来就不用纠结了，建议你直接使用GAPDH做内参就可以了。
yueban-1147 (2013-5-28 16:47:05)

GAPDH 结果很好，建议换用gapdh 不必浪费时间试试
04906 (2013-5-28 16:47:55)

那你二抗换兔来源，一抗不也得换了~你的别的目的条带看来不受鼠源IgG的影响哦