【求助】浓缩胶

最新回复

• ii077345 (2013-10-07 13:50:47)

  可能和样品浓度太高有关吧,有的时候样品太粘稠浓缩胶有弥散的感觉

• yes4 (2013-10-07 13:51:10)

  
  也可能是你的样品处理有问题把

• abc816 (2013-10-07 13:51:35)

  
  和样品有关，我的样品经常在浓缩胶里并不成一条直线，但加大电压到分离胶后就成一条线了。

• 12xunmei (2013-10-07 13:51:55)

  
  我的分离胶电压80v,浓缩胶100v.电压不低啊.我估计是样品的浓度有关,大家都把样品的浓度调成什么浓度啊

• duoduo (2013-10-07 13:52:18)

  对于SDS-PAGE gel 垂直电泳们根据电流进行电泳。mini gel 1枚stacking gel 10mA,running gel 20mA,2枚成倍。standard gel1枚stacking gel 20mA,running gel 40mA。可根据需要加快电流时间，但要防止产热玻璃破碎。

• yonger (2013-10-07 13:52:37)

  
  分离胶电压80v,浓缩胶100v，电压条件可以了，不知道你染色出来的条带清晰不？

• yes4 (2013-10-07 13:52:58)

  
  我有和他类似的问题！我是在浓缩胶里很好，但是到了分离胶，越跑越宽，不规则弥散

  
  12185625.jpg

• yes4 (2013-10-07 13:53:34)

  而且，跑完没有明显的条带，从上到下拖尾很严重，不知道是怎么回事～～～谁能指教一二啊！

  
  49108274.jpg

• rxcc33 (2013-10-07 13:53:54)

  从第一张图看染料似乎多了，你上样量很大吧，染料多倒也不影响分离效果，即使没有浓缩成一条线也没关系。从第二张图看分离效果不好，或者是样品有降解，你跑个marker看看分离效果如何，现在不知道你用的是什么配比和浓度的胶，也不知道是什么样品及其浓度，如果是浓度很大的样品，可尝试稀释后再加样品缓冲液。泛泛的分析原因，不知有没有帮助。

• yes4 (2013-10-07 13:54:11)

  
  第一张图是还没染色的，箭头是溴芬兰，很扩散，不成一条细线，我没说清楚，对不起。第二张是第一张的胶染色，脱色后照的照片，我样品加了复合蛋白酶抑制剂，应该不会降解把？我提取的是淡色库蚊总蛋白，液氮粉碎虫体，按照1克组织加5ml裂解液（8M尿素，4％CHAPS, 65mMDTT），4度一小时，不时颠倒混匀，10000rpm，30min,取上清，15000rpm,20min,取上清，-80度保存。我又跑了一个胶，加了MARKER，MARKER跑得很好，但是没有我提取的蛋白质条带，仍然是拖尾，上样倍比稀世了，1/2，1/4，1/8都没有明显条带，蛋白样品测了浓度，相当于每个孔50微克蛋白，并不高啊！请问分离胶，浓缩胶的Tris的PH，还有电泳缓冲液的PH,是不是都要调得很准？否则就是拖尾？

• 12xunmei (2013-10-07 13:54:30)

  我的SDS跑出来还是能分的清条带的,但是我是marker跑的总是很丑陋，条带象个棒槌，不是很归整的那种，我用的marker是低分子量的，４.１ＫＤ－６６ＫＤ，我跑的是Ｔricine-SDS-PAGE,分离胶的浓度为１６.５％

• eric930 (2013-10-07 13:54:49)

  老兄：浓缩胶电压大了40-50v试试

• newway (2013-10-07 13:55:18)

  我的分离胶电压80v,浓缩胶100v.电压不低啊.我估计是样品的浓度有关,大家都把样品的浓度调成什么浓度啊
  
  ===========================================================================================================
  
  浓缩胶和分离胶的电压是不是搞反了！一般分离胶的电压要比浓缩胶的大，一般我跑蛋白电泳，浓缩胶80~90V,分离胶150~160V，没问题的，跑出来的胶也很漂亮。而且用小胶bio-rad的，也跑得很好。如果觉得蛋白浓度高的话，可以减少上样量，一般是没什么问题的。

• newway (2013-10-07 13:55:39)

  第一张图是还没染色的，箭头是溴芬兰，很扩散，不成一条细线，我没说清楚，对不起。第二张是第一张的胶染色，脱色后照的照片，我样品加了复合蛋白酶抑制剂，应该不会降解把？我提取的是淡色库蚊总蛋白，液氮粉碎虫体，按照1克组织加5ml裂解液（8M尿素，4％CHAPS, 65mMDTT），4度一小时，不时颠倒混匀，10000rpm，30min,取上清，15000rpm,20min,取上清，-80度保存。我又跑了一个胶，加了MARKER，MARKER跑得很好，但是没有我提取的蛋白质条带，仍然是拖尾，上样倍比稀世了，1/2，1/4，1/8都没有明显条带，蛋白样品测了浓度，相当于每个孔50微克蛋白，并不高啊！请问分离胶，浓缩胶的Tris的PH，还有电泳缓冲液的PH,是不是都要调得很准？否则就是拖尾？
  
  ===========================================================================================================
  
  到了分离胶，溴芬兰开始扩散，通常可能是电极缓冲液配的不对或用的次数太多了，没有足够的离子强度推动蛋白向前移动，由于分离胶和浓缩胶的作用不一样，在分离胶中蛋白的移动完全是靠蛋白的分子量，并不具有浓缩效应，所以在分离胶中就开始扩散，一般在跑的时候可以发现跑得很慢。也可能是pH调的不准，在我看来跑胶的时候PH很重要，所以配的时候要注意这一点。蛋白MARKER跑得好，而目的蛋白却不好，有可能是你稀释的太多了，通常在高表达的时候，有必要稀释，一般提取先不要稀释看看，问题不是很大的，而且拖尾不是蛋白浓度高导致的，是因为有杂质，上样前先离下心，比较好。而且就从你的第二张图上看到，也有些像没配浓缩胶，光用分离胶跑的，光用分离胶跑的话，跑出的蛋白条带就是不是一条带，有些散的，而且拖尾很严重。所以也有可能你的问题在浓缩胶上面，没配好浓缩胶。
  

• 12xunmei (2013-10-07 13:56:04)

  是我把两个电压写反了,电压过大会不会产热太厉害啊,我以前用过浓缩胶跑40V电压的，跑的非常慢,差不多两个小时才把浓缩胶跑完

• yes4 (2013-10-07 13:56:29)

  我跑得胶有浓缩胶，我把它切掉了。我重新配了电泳缓冲液，Tris－cl（6.8/8.8），希望会出结果。GOD BLESS ME!

• cwcwcww (2013-10-07 13:56:52)

  嗯 我也觉得是电泳缓冲液老了
  
  我现在都是新配着用 stacking得很平
  
  重复用一次就没有新配得好 从条带上看很明显

• 8黑眼圈8 (2013-10-07 13:57:13)

  
  热扩散在电泳中的控制极端重要，一般的条带变粗都与温度升高引起热扩散有关。接冷凝水循环降温！会有很好的效果！做个预试摸一下最佳的样品浓度。

• 8黑眼圈8 (2013-10-07 13:57:30)

  
  电泳液一般我就用三遍！

• 04906 (2013-10-07 13:57:51)

  我心急，170V从头到尾70分钟；
  我节俭，电泳液一直在用；
  但条带（考染）都很好呀！