第二十九期质谱沙龙活动报道

2010-11-08 16:24 来源: 分析测试百科
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  2010年11月6日下午,第二十九期质谱沙龙活动在北京大学人民医院(北京大学第二临床医院)举行。来自解放军第二炮兵总医院、北京大学人民医院、AB SCIEX公司、天津博纳艾杰尔科技有限公司、北京艾米诺医学研究有限公司等三十余位专家、学者、技术工程师等参加了本次沙龙活动。

第二十九期质谱沙龙活动现场

液相色谱-质谱分析中的基质效应及其解决方案

  北京大学人民医院赵立波博士作了题为《液相色谱-质谱分析中的基质效应及其解决方案》的报告,主要介绍了介绍了液相色谱一质谱(LC—MS)分析中基质效应的产生机制、来源、评定方法和消除措施。

北京大学人民医院 赵立波 博士

  基质效应的产生机制

  LC~MS/MS中的基质效应由分析物的共流出组分影响电喷雾接口的离子化效率所致,表现为离子增强或抑制作用。基质效应由形成带电雾滴时非挥发性的基质组分与分析物离子竞争产生,这些非挥发性基质组分将雾滴牢牢吸在一起,阻止其分裂成更小的微滴。根据接口处离子化和离子蒸发过程中的变化情况,这种竞争可能妨碍(离子抑制)或增强(离子增强)所分析目标物离子的形成效能,亦即分析目标物离子的形成效能与进入电喷雾源的基质密切相关。

  基质效应的来源

  基质效应主要来源于生物样品的内源性组分。内源性组分是指生物样品中存在的有机和无机成分,经前处理后仍存在于提取液中。包括离子颗粒物成分(电解质、盐类)、强极性化合物(酚类、色素)和各种有机化合物(糖类、胺类、尿素、脂类、肽类及其分析目标物的同类物及其代谢物)。其中磷脂是最主要的内源性组分,其对电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)均会产生离子抑制作用,具有表面活性的甘油磷脂酰胆碱是最强的内源性组分 。

  外源性组分在生物样品中不存在,但同样会带来基质效应,其由样品前处理过程引入,包括塑料和聚合物的残留、邻苯二甲酸盐、清洁剂(烷基酚)、离子对试剂、有机酸、缓冲液、SPE柱材料、流动相等。另外,APCI离子化方式比ESI对基质效应更敏感。基质效应不但与离子化方式有关,而且与各个仪器厂家的源设计也有关。

  基质效应的评定

  通过评定基质对分析物信号的影响程度,可大致将基质效应的评定归结为2种方法:柱后注射法和提取后添加法。柱后注射法属于动态方法,注射泵和接色谱柱的液相系统通过三通接头与质谱连接。注射泵恒流注射一定浓度的分析物;生物样品不添加分析物,提取后按已定的色谱条件进样,记录分析物的响应,此方法可考察整个色谱循环的基质影响。提取后添加法是采用提取后添加法建立数学模型评定基质效应在LC—MS/MS中使用的最多,而且,此法可同时考察提取回收率。

  基质效应的消除

  LC—MS分析时的基质效应客观存在,并随生物样品的不同而不同。赵博士介绍了四种基质效应消除的方法——样品前处理、同位素内标、更换离子源和调整流动相,重点讲解了前两种。

   样品前处理

  改进前处理方法、纯化样品、尽可能地减少最终提取液中的基质成分是最有效、彻底地消除基质效应的方法 生物样品的前处理方法很多,研究普遍认为利用有机溶剂蛋白质沉淀法或稀释法处理的样品,其基质效应明显高于SPE或LLE方法。

  通过基质效应评定的方法,可系统检查基质效应产生的环节。例如,尿液中的肌酸酐或木脂素可较强抑制激素类分析,应通过前处理过程去除。在样品进样前进行稀释也可降低其基质效应,但此法在超痕量分析时不适用。尽管样品前处理过程繁琐,但样品纯化仍是最佳的基质效应消除方法

  同位素内标

  同位素内标不但可抵消质谱离子化时的基质效应,还可消除样品前处理过程中的差异。但同位素内标购置困难,且在多个分析物同时检测时,由于存在极性差异,即使是同类物的同位素内标也很难抵消基质效应,造成定量结果偏差:例如,采用原体药物的同位素内标同时分析某药物及其葡萄糖苷结合物,则该内标无法抵消极性较强的葡萄糖苷结合物的质谱离子化变化。


液相色谱梯度方法的开发及其在质谱定量技术中的应用

  解放军第二炮兵总医院李鹏飞老师作了题为《液相色谱梯度方法的开发及其在质谱定量技术中的应用》的报告,主要介绍了梯度洗脱的特点、方式、步骤和开发。

解放军第二炮兵总医院 李鹏飞 老师

  梯度洗脱基本知识

  梯度性地改变洗脱液的组分(成分、离子强度等)或pH,以期将层析柱上不同的组分洗脱出来的方法,在同一个分析周期中,按一定程度不断改变流动相的浓度配比,称为梯度洗脱。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。

  梯度洗脱的优点是:单位时间的分离能力增加,检测灵敏度提高,使样品与溶剂前沿基线分离,降低基质干扰;缺点是:仪器设备要求高,不适合某些检测方式,柱需再生-增加分析时间,基线漂移。提高柱效改善检测器的灵敏度当样品中的一个峰的k'值和最后一个峰的k'值相差几十倍至几百倍时,使用梯度洗脱效果特别好。梯度洗脱中为保证流速的稳定,必须使用恒流泵,否则难获重复结果。梯度洗脱常用一个弱极性的溶剂A和一个强极性的溶剂B。

  梯度洗脱步骤

  梯度洗脱的一般步骤是:1)选择两种合适的溶剂A和B。2)进行初步分离。3)在接近tO处如果谱带挤在一起,则应降低初始溶剂A的强度,若谱带远离色谱图的开始部分,则应增大A的强度;如果需要洗脱很长时间,则应增加溶剂B的强度;如果所有的谱带都在比较靠前的位置被洗脱,则应降低B的强度。4)如有必要可以调节斜率;为增大灵敏度可以增加斜率,为增大分离度,可以降低斜率。5)必要时为提高选择性可改变溶剂B。6)解决具体问题,比如溶剂分层,没有有效的弱溶剂A时,可以用梯度延迟来解决谱图前部分分离不良的问题。

  梯度洗脱平衡时间大于8~9分钟,平衡即充足,有机污染物影响梯度分析,如“三蒸水”有大量有机污染物不适合做梯度分析。

  梯度方法开发实例

  第一步,开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法,用C18柱,在最初的条件下(0-100%,水-乙腈),分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长,分离度叶不好。

  第二步,为使色谱峰前移,提高起始时乙腈的比例(50-100%,水-乙腈),分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰,说明有杂质存在,很可能是流动相水中的。

  第三步,从空白梯度图显示,在同样的色谱条件,同样的检测灵敏度下,共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。

  第四步,空白梯度图同样品的色谱图进行对照后,我们看到杂质(共两个峰)中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰,会使其定量分析结果不准确。

  第五步,根据“梯度曲线下的面积越大,洗脱能力越强”的规律,试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5,50-100%B),但是小峰仍没有分出来。

  第六步, 根据“梯度曲线下的面积越大,洗脱能力越强”的规律,试用#5曲线使3-9号峰提前,改用50-95%B见到好的现象。

  第七步,最后用50-95%B,得到好的结果。

  梯度方法开发首先要明确目标,如整个色谱峰组保留时间太长,分离度也不好,杂质分离等;然后对症下药,如为使色谱峰前移,提高起始乙腈的比例,分离得到改善。

  最后,李老师又介绍了其它几种梯度形式并用赵老师的话总结了选择梯度的原因:不管是作单一的还是多个化合物的分析,液质联用尽量用梯度洗脱,以来可以使质谱峰形更窄,灵敏度更高;更重要的是可以降低成本,比如对一根新色谱柱,走等度可走1000针,而梯度可以到2000针;梯度方法里,柱子被清洗得更干净。